一、背景介紹

阿爾茨海默病(AD)是一種影響認知能力和行為表現的神經退行性疾病，目前面臨早期確認信號缺乏以及預后的精確度差等問題。相比于腦脊液、血液等，唾液具有無創(chuàng)且便于獲取等優(yōu)點，是一種很有前景的生物體液，可以促進AD生物標志物研究的多樣化。加拿大皇家科學院厲良教授采用高效化學同位素標記（High Performance-Chemical Isotope labeling，HP-CIL）代謝組學技術，收集認知正常(CN)、輕度認知障礙(MCI)和阿爾茨海默?。?strong>AD）人群的唾液樣本，進行全面代謝組學分析，探索與AD相關的潛在生物標志物。

二、研究路線

本研究使用了HP-CIL代謝組學技術分析CN、MCI和AD人群的唾液樣本之間的代謝物差異。其中發(fā)現集（DP）：MCI（n=25）、AD（n=22）和CN（n=35），驗證集（VP）：MCI（n=10）、AD（n=7）和CN（n=10）。圖1為本研究的工作流程。

三、研究結果

01唾液代謝組的特征

我們分析了發(fā)現集（DP）中82份唾液樣本，共獲得了6230個獨特的峰對，在50%以上的樣品中普遍檢測到3801個峰對。根據精確分子量和保留時間，匹配丹磺?；瘶藴势窋祿欤–IL Library）79種代謝物，以及使用精確分子量，在MyCompoundID (MCID)數據庫識別到3588種代謝物。在神經退行性疾病方面的研究，與現有的唾液、血液代謝組學技術相比，HP-CIL代謝組學技術的整體代謝組覆蓋率顯著提升。

02多變量統(tǒng)計分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）可以發(fā)現組間有一些初始分離，但CN和MCI組間分離不是很明顯，表明MCI和CN組間的代謝組學差異低于AD和CN組間；正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal projections to latent structures，OPLS-DA）顯示三組顯著分離，具有高驗證參數(R2Y=0.93和Q2Y=0.79)，證明了模型的穩(wěn)健性；為了觀察從不同人群的唾液代謝變化進展，繪制在三組人群的OPLS-DA?3D圖，結果表明代謝變化顯著，其中MCI組位于中間位置，而AD組距離CN組較遠。（圖2）

03?AD診斷生物標志物的篩選和驗證

圖3表明，不同組間OPLS-DA圖都有明顯的組分離和有效性指標，證實了模型良好的擬合度和預測能力。在AD與CN比較的火山圖中，AD組與CN組有175種顯著差異代謝物，AD組與MCI組有142種差異代謝物，MCI組與CN組有59種差異代謝物（p＜0.01，FC＞1.2）（圖4）。結合OPLS-DA和火山圖分析的結果，選擇在兩種分析中都有意義的代謝物，并對其進行受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic curve，ROC)分析。

運用HP-CIL代謝組學技術對驗證集樣本（VP）進行代謝物檢測。在三組27個樣本中檢測到4157個峰對。其中，50%以上的樣品中普遍存在3184個峰對。根據DP和VP的AUC≥0.75標準，分別在AD與CN(n=63)、AD與MCI(n=48)和MCI與CN(n=2)的比較中，識別出許多代謝物，其表現持續(xù)良好。其中，確定了區(qū)分AD和CN的4種代謝物(苯丙氨酰-丙氨酸、尿毒酸、苯丙氨酰-苯丙氨酸和色氨酸-酪氨酸)，區(qū)分AD和MCI的3種代謝物(苯丙氨酰-脯氨酸、丙氨酰-苯丙氨酸、苯丙氨酰-甘氨酸)。

04AD診斷模型的建立和驗證

使用MetobAnalyst對DP的三組樣本進行兩兩比較，根據結果開發(fā)了診斷模型（表1）。使用前3種代謝物(甲基鳥苷、組二酰苯丙氨酸、膽堿-胞苷)區(qū)分AD和CN，DP中AUC=1.000，VP中的AUC=1.000，診斷敏感性為100%，特異性為100%；使用相應的前3種謝物(氨基二酚、葡萄糖半乳糖羥賴氨酸-H2O、氨基丁酸+H2)區(qū)分AD與MCI，DP中的AUC=1.000，VP中的AUC=1.000，靈敏度為100%，特異度為100%；使用前2種代謝物(葡萄糖基半乳糖羥基賴氨酸H2O、谷氨酰胺卡尼汀)，區(qū)分MCI和CN，DP中的AUC=0.779，VP中的AUC=0.889，敏感性為100%，特異性為70.0%。在兩兩比較中觀察到的兩個小組(CN與AD和MCI與AD)的辨別性能大大好于第三個小組(MCI與CN)。

表2為使用明確代謝物建立了診斷模型列表。結果表明，使用三種明確代謝物苯丙氨酰-脯氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸和尿囊酸的生物標志物組合區(qū)分AD和CN，在DP和VP中產生的AUC值分別為0.820和0.814，敏感性為71.4%，特異性為90.0%；使用丙氨酰-苯丙氨酸和苯丙氨酰-脯氨酸組成的雙標記物對區(qū)分AD和MCI，DP組AUC值為0.881，VP組AUC值為0.786，敏感性為71.4%，特異性為80.0%。

為了檢查VP數據的結果，我們對DP和VP組合的數據集執(zhí)行了另一組ROC分析，同時分析這兩個數據集提供了一種間接的方法來交叉驗證此前發(fā)現的生物標志物面板性能。在表1和表2中展示AUC、靈敏度和特異度結果的總體分析。圖5和圖6顯示ROC曲線和排列測試。在所有情況下，排列測試結果都是顯著的(p<0.01)。對原始驗證數據的這種全樣本檢查表明，表1和表2所示的生物標志物小組的表現穩(wěn)健，發(fā)現的潛在生物標志物可有效進行不同人群的區(qū)分。

05代謝通路

在AD與CN和AD與MCI的比較中，有6個二肽顯著失調。唾液中顯著上調的二肽可以作為診斷生物標志物，能夠有效區(qū)分AD組和CN組，甚至AD組和MCI組。在DP與VP中，AD組與CN組也檢測到尿毒酸有一致的變化。本研究還發(fā)現AD患者唾液中尿毒酸水平失調，其尿毒酸濃度是CN組的3倍，這種差異可能是由于尿毒酸代謝的物種特異性所致。然而，唾液中尿原酸的失調支持了AD患者組胺能系統(tǒng)潛在的生物學紊亂，并表明了免疫調節(jié)和炎癥過程在AD進展過程中的重要性。

四、研究結論

本研究采用HP-CIL代謝組學技術對唾液樣本進行系統(tǒng)分析，構建了一種使用唾液發(fā)現AD的診斷生物標志物的方法，高質量的數據結果突出了其在AD研究中的重要作用，結合機器學習開發(fā)的潛在生物標志物有望實現AD的精確鑒別診斷。