??上兩期我們介紹了神經(jīng)科學(xué)實驗的一大神器—光遺傳學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用，感興趣的小伙伴可以往前查看了解。本期將給大家介紹與光遺傳學(xué)技術(shù)類似、也是神經(jīng)研究中的一項熱門技術(shù)，即化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)（Chemogenetic）。

?????? 化學(xué)遺傳學(xué)是化學(xué)與遺傳學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)，通過小分子化合物與配體依賴性受體相互作用，激活受體及其下游信號，進(jìn)而激活或抑制細(xì)胞活動?；瘜W(xué)遺傳學(xué)的起始發(fā)展還稍早于光遺傳學(xué)，自上世紀(jì)90年代至今，已有多種生物大分子被開發(fā)改造用以識別特定的小分子配體，這些生物大分子包括核酸雜交物、激酶、多種代謝酶和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。其中基于GPCR的化學(xué)遺傳學(xué)平臺較為常用，包括等位基因特異性激活的基因編碼受體（allele-specific activation of genetically encoded receptors）、僅由合成配體激活的受體（receptors activated solely by synthetic ligands，RASSLs）以及僅由設(shè)計藥物激活的設(shè)計受體（designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs）等工程化受體。DREADDs是目前應(yīng)用最廣泛且效果最好的一種化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)，可用于控制細(xì)胞信號和神經(jīng)元活動等。

DREADDs

????? DREADDs由CNO（氯氮平-N-氧化物）特異性激活，引起各種GPCR級聯(lián)信號傳遞。GPCRs是由細(xì)胞外配體（如神經(jīng)遞質(zhì)、激素等）激活的一種細(xì)胞表面受體，它與異源三聚體G蛋白相結(jié)合，G蛋白分別由α、β和γ亞基組成，其中Gα亞基又有四種不同的亞型（Gs、Gi、Gq和G12）。當(dāng)GPCRs與配體結(jié)合后，會激活G蛋白，Gα亞基則從三聚體中解離，進(jìn)入胞漿激活下游信號腺苷酰環(huán)化酶(AC)或酶磷脂酶C(PLC)，由不同的Gα亞型產(chǎn)生不同生物學(xué)效應(yīng)。在DREADDs中常使用Gq和Gi這兩種亞型偶聯(lián)的受體。

圖1 基于人毒蕈堿乙酰膽堿受體（mAchR）的DREADDs[1]

（1）Gq-DREADDs

Gq-DREADD是由人毒蕈堿乙酰膽堿受體M3（hM3）經(jīng)定向改造而來的，在hM3中引入Y3.33C和A5.46G兩個點突變，該突變體成為hM3Dq。hM3Dq表現(xiàn)出對CNO的選擇性結(jié)合，同時對內(nèi)源性乙酰膽堿不敏感，且未激活狀態(tài)的活性水平很低。一般情況下，Gq-DREADD受體即指hM3Dq，這是使用最為廣泛的興奮性DREADDs。在神經(jīng)元中，激活hM3Dq可以使神經(jīng)元發(fā)生去極化并增強它們的興奮性；另外也可以使其他細(xì)胞類型的活躍度。值得注意的是，失活狀態(tài)的hM3Dq不會增加目的細(xì)胞的基礎(chǔ)活性。

（2）Gi- DREADD

?????? 在所有已知的mAchR中有兩個保守位點Y3.33和A5.46，Gi- DREADD也是在這兩個位點進(jìn)行了突變，構(gòu)建M4 mAchR的Y3.33C和A5.46G突變體，并命名為hM4Di。hMD4i可以在配體的結(jié)合下激活Gi介導(dǎo)的細(xì)胞信號。GPCR偶聯(lián)的Gi可以激活G蛋白內(nèi)向整流鉀通道（GIRK），誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生超極化、抑制其放電，使神經(jīng)元活動受抑制。

DREADDs選擇性配體CNO

CNO是FDA批準(zhǔn)上市藥物-氯氮平的代謝產(chǎn)物，體內(nèi)應(yīng)用相對安全。作為非典型的治療精神疾病的藥物氯氮平的代謝物，CNO在嚙齒類動物中沒有生物活性，缺少與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的親和力。CNO在正常情況下與GPCR結(jié)合后啟動磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞內(nèi)鈣離子三條信號通路。CNO廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)神經(jīng)元以及小鼠和大鼠。對動物實驗而言，CNO可以使用注射的方式，也可以將其摻在食物或者飲用水中，而后者對于長期實驗更加方便，可以避免注射時人為因素的影響。但是這種方式很難控制CNO 的攝取率。CNO會引起一些副作用包括低血壓、鎮(zhèn)靜、抗副交感神經(jīng)綜合征。但是，只要藥物濃度盡量低，而且設(shè)置必要的對照動物（檢測無關(guān)蛋白，如GFP），這些副作用可以被忽略。

一般實驗方法

1. 根據(jù)實驗?zāi)康?，確定合適的DREADDs受體：激活神經(jīng)元活性，選擇hM3Dq；抑制神經(jīng)元的活性，則選擇hM4Di；

2. 將遺傳信息導(dǎo)入到動物體內(nèi)：一般通過病毒注射或者轉(zhuǎn)基因動物的方式將遺傳信息傳遞給靶細(xì)胞；結(jié)合AAV的特異性血清型和啟動子，可以很好地將DREADDs遞送到目的組織或細(xì)胞；

圖2 以AAV為載體向靶細(xì)胞遞送DREADDs受體[2]

?表1. 漢恒化學(xué)遺傳學(xué)AAV工具

3. 可控性演示：即通過控制CNO的給藥時間，實現(xiàn)對細(xì)胞神經(jīng)元活動的控制；

4. 實驗方法的有效性驗證：一般采用電極記錄神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)外電壓變化，以此來驗證DREADDs受體的有效性；

5. 表型檢測：通過實驗確認(rèn)激活或者抑制神經(jīng)元活動給實驗動物帶來的影響。

?????? 以上則是化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)的基本內(nèi)容，如果有感興趣的小伙伴可以進(jìn)一步與我們溝通聯(lián)系，漢恒將為您提供優(yōu)質(zhì)的病毒載體和服務(wù)。下期小編將通過實際案例給大家分享下化學(xué)遺傳學(xué)的應(yīng)用，敬請期待。

參考文獻(xiàn)：

[1] Meister J, Wang L, Pydi SP, Wess J. Chemogenetic approaches to identify metabolically important GPCR signaling pathways: Therapeutic implications. J Neurochem. 2021 Aug;158(3):603-620.

[2] Urban DJ, Roth BL. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015;55:399-417.