前言

歐易/鹿明生物合作客戶孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院李建明團(tuán)隊(duì)在Microbiome（IF：11.607）發(fā)表了題為 “EphB6基因缺陷小鼠的腸道菌群通過介導(dǎo)維生素B6動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)自閉癥樣行為”的文章，通過16S rRNA基因測(cè)序和LC-MS非靶向代謝組學(xué)聯(lián)合分析等手段，揭示了腸腦微生物群軸對(duì)自閉癥譜系障礙（ASD）的發(fā)展有重大影響，深入而透徹地闡明了腸道菌群影響小鼠腦功能缺陷的新機(jī)制。

英文標(biāo)題：EphB6基因缺陷小鼠的腸道菌群通過介導(dǎo)維生素B6動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)自閉癥樣行為

研究對(duì)象：小鼠糞便、腦組織

發(fā)表期刊：Microbiome

影響因子：11.607

單位：孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院

發(fā)表時(shí)間：2020年8月

主要運(yùn)用歐易/鹿明生物技術(shù)：16S rRNA基因測(cè)序（歐易生物提供技術(shù)服務(wù)），LC-MS非靶標(biāo)代謝組（鹿明生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

自閉癥譜系障礙（ASD）是一種發(fā)育障礙性疾病，目前對(duì)自閉癥的核心癥狀的有效治療很有限。ASD患者臨床研究證據(jù)表明，腸道菌群與ASD發(fā)展之間存在聯(lián)系，但腸道菌群與ASD的腦功能障礙（腸腦軸）聯(lián)系機(jī)制尚未完全闡明。

在腸道穩(wěn)態(tài)起著重要作用的EphB6基因（位于7q號(hào)染色體，屬于受體酪氨酸激酶Eph家族），因基因突變和在ASD患者中表達(dá)下調(diào)，被認(rèn)為是ASD的候選基因。但尚不清楚EphB6在調(diào)節(jié)腸道菌群和ASD發(fā)生的作用機(jī)制。

本研究中作者發(fā)現(xiàn)EphB6在功能上與ASD相關(guān)，并通過腸道菌群介導(dǎo)的維生素B6和多巴胺，調(diào)節(jié)患者自閉癥樣行為。作者建立了EphB6基因缺陷小鼠腸道菌群失調(diào)與中央前額葉皮層（mPFC）（關(guān)鍵的腸腦功能軸）的興奮/抑制失衡之間的功能聯(lián)系。

研究思路

實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)樣本

基于C57BL/6J小鼠系的健康雄性EphB6+/+（WT）和EphB6-/-（KO）小鼠模型。

2.主要實(shí)驗(yàn)方法

（1）蛋白和轉(zhuǎn)錄分析：蛋白質(zhì)印記分析、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析；

（2）16S rRNA基因測(cè)序分析；

（3）代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)：LC-MS非靶向代謝組學(xué)分析，氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)LC-MS靶向分析，5-磷酸吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇靶向分析；

（4）其他：蘇木精-伊紅組織染色、腸通透性測(cè)定、小鼠行為測(cè)試、立體定向手術(shù)和藥物顯微注射、腦組織電生理學(xué)檢測(cè)；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.缺失EphB6導(dǎo)致小鼠自閉癥樣行為和腸道微生物紊亂

自閉癥樣行為增加：作者發(fā)現(xiàn)KO小鼠比WT小鼠梳理毛發(fā)的時(shí)間更多（圖1a），且在社交分區(qū)測(cè)試中社交互動(dòng)異常。KO小鼠在嗅覺適應(yīng)性/不適應(yīng)性測(cè)試中對(duì)充滿社交氣味的棉簽興趣較少（圖1i），表現(xiàn)出交流障礙。在高架十字迷宮測(cè)試中，KO小鼠在開臂處時(shí)間更少，而在閉臂時(shí)間更長(zhǎng)（圖1j），表明KO小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。總之EphB6的缺失導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)自閉癥樣行為，包括刻板行為和社會(huì)缺陷，以及焦慮樣行為，但沒有表現(xiàn)出智力障礙。

腸通透性提高：與WT小鼠相比，KO小鼠的腸通透性顯著提高（圖1k）。此外，KO小鼠結(jié)腸中緊密連接分子Cldn4的mRNA表達(dá)更低，IL-1β（促炎因子）mRNA表達(dá)大幅增加，且有抗炎作用的IL-6表達(dá)降低，而回腸遠(yuǎn)端、結(jié)腸、肝和肺的形態(tài)學(xué)沒有改變。

糞便微生物組成變化：Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析表明，KO與WT小鼠的糞便微生物群組成不同（圖1p），主要差異在KO小鼠糞便菌群中脫鐵桿菌門的粘膜螺旋藻屬豐度降低（圖1q）。

上述結(jié)果表明小鼠EphB6的缺失導(dǎo)致腸道通透性增加和腸道微生物組成發(fā)生變化。4周齡KO與WT小鼠的主坐標(biāo)分析中，腸道菌群組成不同，但3周齡小鼠腸道菌群組成相似。同時(shí)4周齡的KO小鼠表現(xiàn)出刻板行為增加和對(duì)社交氣味興趣降低，進(jìn)一步暗示異常行為與EphB6缺失小鼠中腸道微生物紊亂之間的可能關(guān)系。

圖1 | 缺失EphB6導(dǎo)致小鼠自閉癥樣行為和腸道微生物紊亂

2.移植EphB6基因缺陷小鼠的糞便菌群在C57BL/6J小鼠中引起自閉癥樣行為

將8周齡的雄性WT或KO小鼠糞便菌群灌胃給3周齡SPF雄性C57BL/6J小鼠（圖2a），三周后發(fā)現(xiàn)兩組小鼠腸道微生物組成不同（圖2b），同時(shí)發(fā)現(xiàn)接受KO小鼠糞便微生物群的C57BL/6J小鼠表現(xiàn)出刻板行為增加和社交行為減少（圖2e-i）。另外對(duì)SPF雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行抗生素預(yù)處理后進(jìn)行WT或KO小鼠糞便菌群灌胃實(shí)驗(yàn)，2周后發(fā)現(xiàn)兩組小鼠腸道微生物組成不同，而且接受KO小鼠糞便微生物群的C57BL/6J小鼠表現(xiàn)出刻板行為增加和社交行為減少。總之，來自EphB6基因缺陷小鼠的糞便微生物群在C57BL/6J小鼠中引起了刻板行為的增加和社會(huì)行為的部分受損。

圖2 | 移植EphB6基因缺陷小鼠的糞便菌群在3周齡的SPF C57BL/6J小鼠引起自閉癥樣行為

為驗(yàn)證腸道微生物群是否在成年小鼠的自閉癥樣行為中持續(xù)發(fā)揮作用，給6周大的SPF C57BL/6J雄性小鼠口服抗生素混合物1周破壞腸道菌群后，小鼠表現(xiàn)出社交能力障礙。作者還發(fā)現(xiàn)KO小鼠腸道菌群的代謝產(chǎn)物在C57BL/6J小鼠中誘發(fā)了部分社交缺陷（圖3j-m）。而KO小鼠中去除代謝產(chǎn)物的腸道菌群也會(huì)在C57BL/6J小鼠中引起部分社交缺陷。結(jié)果表明即使在成年小鼠中，腸道菌群也與自閉癥樣行為相關(guān)，并且不同的腸道細(xì)菌可能參與調(diào)節(jié)不同的行為。

圖3 | 移植EphB6基因缺陷小鼠糞便菌群會(huì)誘導(dǎo)6周齡SPF C57BL/6J小鼠的部分社交缺陷

3.移植野生型小鼠糞便菌群改善成年EphB6基因缺陷小鼠的自閉癥樣行為

16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果表明，接受WT小鼠腸道菌群的KO小鼠糞便中脫鐵桿菌門的粘膜螺旋藻屬相對(duì)豐度增加（圖4c）。功能分析表明，接受WT小鼠腸道菌群的KO小鼠表現(xiàn)出社交行為增加（圖4f-i），且刻板行為有降低的趨勢(shì)（圖4e）?？傊?，腸道微生物紊亂是導(dǎo)致EphB6缺失小鼠的自閉癥樣行為的原因。

圖4?| 移植野生型小鼠糞便菌群改善了成年EphB6基因缺陷小鼠的自閉癥樣行為

4.腸道菌群介導(dǎo)的維生素B6動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)EphB6基因缺陷小鼠的社交行為

作者通過實(shí)驗(yàn)探索腸道菌群影響大腦并在EphB6基因缺陷小鼠中引起自閉癥樣行為的機(jī)制。有研究表明ASD與海馬體、小腦和中央前額葉皮層（mPFC）有關(guān)，KO小鼠mPFC中c-Fos蛋白表達(dá)顯著高于WT小鼠。對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)來說mPFC太小，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用了PFC。

因?yàn)镵O小鼠腸道菌群的代謝產(chǎn)物也引起了C57BL/6J小鼠的社交缺陷，作者假設(shè)某些受腸道微生物影響的物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致KO小鼠的社交缺陷。使用LC-MS非靶向代謝組學(xué)方法檢測(cè)了小鼠PFC中代謝物，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠之間有顯著差異（圖5a），差異代謝物富集到的代謝通路包括維生素B6代謝途徑，主要因?yàn)镵O小鼠中該途徑的吡哆胺（PM）和吡哆醛5'-磷酸（PLP）相對(duì)豐度降低（圖5b-d）。

人體維生素B6主要來自飲食和腸道細(xì)菌合成，然后被腸道吸收。檢測(cè)小鼠糞便、血液和PFC中維生素B6含量發(fā)現(xiàn)，EphB6基因缺陷小鼠糞便中吡哆醇（PN）含量升高，血漿PM和PLP含量降低，前額葉皮層PLP含量降低。（圖5e-k）。接受WT小鼠腸道微生物移植一周后，KO小鼠糞便中PN含量降低，血漿中PM含量升高，PFC中PLP含量升高。這些結(jié)果表明，腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)腸道中維生素B6吸收來調(diào)節(jié)小鼠糞便、血液和PFC中維生素B6水平。

圖5 | 腸道菌群調(diào)節(jié)EphB6缺陷小鼠的維生素B6

作者又向KO小鼠補(bǔ)充維生素B6，以闡明其對(duì)自閉癥樣行為的影響。腹腔注射1 mg PLP后一小時(shí)，與對(duì)照組小鼠相比，KO小鼠的血漿PLP水平較高（圖6b），社交行為增加（圖6d-f），但相同處理對(duì)C57BL/6J小鼠的社交行為沒有影響（圖6h-j）。另外使C57BL/6J小鼠缺乏維生素B6，2周后血漿PLP水平降低，小鼠社交行為降低（圖6k-n）。結(jié)果證明了腸道菌群誘導(dǎo)的維生素B6缺乏與EphB6基因缺陷小鼠的社會(huì)缺陷之間存在聯(lián)系。

圖6 | 腸道菌群介導(dǎo)的維生素B6動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)EphB6缺陷小鼠的社交行為

5.腸微生物群介導(dǎo)的維生素B6動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)EphB6基因缺陷小鼠腦前額葉皮層中的多巴胺

維生素B6參與細(xì)胞多個(gè)生化反應(yīng)，包括氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)生物合成和分解代謝。通過靶向代謝組學(xué)檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)給予無菌PBS或WT小鼠糞便微生物群的WT和KO小鼠PFC中，谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺水平相似（圖7a/b）。與WT小鼠相比，KO小鼠PFC中多巴胺降低、5-羥色胺（5-HT）增加（圖7c）。與給予無菌PBS相比，用WT小鼠糞便菌群處理可增加KO小鼠PFC中多巴胺，但不影響5-HT。另外接受KO小鼠糞便菌群移植的SPF C57BL/6J小鼠，PFC中多巴胺水平低于接受WT小鼠糞便菌群移植的小鼠。腹腔內(nèi)注射PLP可增加KO小鼠PFC中多巴胺水平（圖7d），維生素B6缺乏可降低SPF C57BL/6J小鼠PFC中的多巴胺水平（圖7e）。總之，腸道菌群介導(dǎo)的維生素B6動(dòng)態(tài)平衡影響小鼠PFC多巴胺水平。

向KO小鼠mPFC中注射多巴胺D1受體（D1R）或多巴胺D2受體（D2R）（喹吡羅）的激動(dòng)劑，發(fā)現(xiàn)與注射人工腦脊髓液（ACSF）相比，注射D1R的KO小鼠表現(xiàn)出社交行為增強(qiáng)（圖7g-j），但注射D2R的KO小鼠沒有。注射ACSF和D1R激動(dòng)劑的C57BL/6J小鼠沒有發(fā)現(xiàn)社交行為的差異（圖7k-m），但D1R拮抗劑導(dǎo)致C57BL/6J小鼠社交行為的降低（圖7n-q）。總之，在EphB6基因缺陷小鼠中腸道菌群失調(diào)和維生素B6缺乏可通過D1R介導(dǎo)的途徑導(dǎo)致自閉癥樣行為。

圖7 | 腸道菌群通過維生素B6調(diào)節(jié)多巴胺進(jìn)而影響EphB6基因缺陷小鼠的社交行為

6.腸道菌群調(diào)節(jié)EphB6基因缺陷小鼠中央前額葉皮層中的E/I平衡

為研究EphB6基因缺陷小鼠腸道微生物群介導(dǎo)的自閉癥樣行為的細(xì)胞機(jī)制，作者記錄了接受無菌PBS或WT小鼠糞便微生物群處理的WT和KO小鼠mPFC的錐體神經(jīng)元的自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSCs）和自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）。sEPSC幅度和頻率以及sIPSCs的幅度在各組之間沒有差異（圖8b-f），而KO小鼠中sIPSCs的頻率降低，接受WT小鼠糞便菌群移植可以改善這種情況（圖8g-k）。另外，接受KO小鼠糞便微生物處理的C57BL/6J小鼠mPFC的錐體神經(jīng)元中sIPSC的頻率降低。總之，腸道菌群在EphB6基因缺陷小鼠的mPFC錐體神經(jīng)元中通過多巴胺調(diào)節(jié)了E/I平衡（圖9）。

圖8 | 腸微生物群和多巴胺調(diào)節(jié)EphB6缺陷小鼠mPFC中的E/I平衡