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Selli等人發(fā)現(xiàn)，雖然攜帶CD28的嵌合抗原受體（CAR）T細胞通過腫瘤或慢性感染刺激下發(fā)生的經(jīng)典事件，從而發(fā)生功能障礙和耗竭，但攜帶4-1BB的CAR-T細胞則以由轉(zhuǎn)錄因子FOXO3驅(qū)動的不同方式發(fā)生功能障礙。

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十多年前，CAR-T細胞被證明對B細胞惡性腫瘤具有顯著的療效。它們均靶向B細胞分子CD19，并帶有CD28或4-1BB中1個共刺激分子的胞內(nèi)信號域。研究者假設將共刺激結(jié)構(gòu)域并入CAR可改善持久性和功能，從而改善抗腫瘤作用。由于這些初始產(chǎn)品取得顯著的初步成功，美國食品和藥物管理局批準的所有6種構(gòu)建物，包括針對骨髓瘤漿細胞表達的b細胞成熟抗原的構(gòu)建物，以及臨床開發(fā)中的大多數(shù)其他CAR，包括各種適應癥，都包含這兩個信號域中的一個。

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由于CAR以高親和力識別抗原，并且由組成型啟動子表達，因此研究者早期注意到，抗原的持續(xù)刺激（有時甚至是CAR的高水平表達）可導致T細胞功能障礙。這些功能失調(diào)的T細胞在抗原刺激后的細胞毒性、細胞因子產(chǎn)生和增殖能力降低；這可以通過中斷信號轉(zhuǎn)導中的休息來克服。在患者中，高腫瘤負荷與應答降低和T細胞功能障礙增加相關。到目前為止，這種功能障礙被認為在本質(zhì)上與T細胞“耗竭”是相同的現(xiàn)象，而T細胞“耗竭”已經(jīng)在接受檢查點阻斷治療的慢性病毒感染和癌癥中得到了廣泛描述。

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Selli等通過重復體外刺激攜帶CD28或4-1BB胞內(nèi)信號域的CD19導向的CAR T細胞來模擬慢性激活，從而產(chǎn)生功能障礙，然后對轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和表型程序進行了全面分析。每48小時用低效靶比的新腫瘤細胞刺激CAR T細胞。2周后，CAR T細胞失去了殺傷抗原陽性靶點的能力，不能再產(chǎn)生細胞因子，也不能再增殖。接下來，他們利用飛行時間的多參數(shù)細胞測定法從表型上研究了這些功能失調(diào)的CAR T細胞。研究發(fā)現(xiàn)，含有CD28的CAR - T細胞具有典型T細胞耗竭的特征，包括PD-1、TIGIT、LAG3、TIM3和CTLA4的重新表達（見圖）。相比之下，攜帶4-1BB CARs的功能失調(diào)T細胞占據(jù)不同的T分布隨機鄰居嵌入空間，其表面表達更高的CD62L和CD25。使用RNA測序檢查這些功能失調(diào)的CAR T細胞的轉(zhuǎn)錄程序顯示，基于CD28的CAR T細胞高度富集與耗竭相關的基因，而基于4- 1BB的功能失調(diào)的CAR T細胞沒有典型的耗竭標簽。

最近關于T細胞衰竭的研究強調(diào)，這種狀態(tài)是由特定的表觀遺傳改變決定的。研究人員還使用染色質(zhì)開放性測序技術（ATAC-seq）證實了這些差異，特別是PD1編碼基因（PDCD1）的染色質(zhì)可及性測定法，在基于CD28的CAR T細胞中，這看起來像是典型的耗竭，但在基于4- 1BB的CAR T細胞中并非如此。研究人員隨后使用縱向單細胞RNA測序，確定大多數(shù)功能失調(diào)的4-1BB CAR T細胞是由一組涉及細胞毒性（GNLY、CCL5、PRF1、GZMA、GZMK、CTSW）、自然殺傷細胞特性（KLRK1、KLRC2）和T細胞分化（ID2）的獨特基因定義，他們將這些基因稱為TBBD標簽。有趣的是，他們的TBBD標簽在接受抗CD19 /4- 1BB?CAR構(gòu)建物Tisagenlecleucel治療的1例患者中得到了證實，該患者雖然血液中有CAR T細胞，但淋巴瘤仍發(fā)生進展。

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攜帶不同共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細胞在慢性刺激后功能失調(diào)時表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和表型特征。攜帶4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細胞重新激活FOXO3，其驅(qū)動一種不同于經(jīng)典T細胞衰竭的新功能障礙程序。

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為了了解這種功能障礙的新型分子程序的起源，研究團隊研究了隨著時間的推移轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的可及性。正如預期的那樣，CD28-CAR功能障礙增加了Jun:Fos（AP1）結(jié)合的可及性，但相反，4-1BB-CAR功能障礙打開了同源盒（HOX）和叉頭框（FOX）位點，并且小的條理性RNA測序數(shù)據(jù)顯示FOXO3活性高。此外，在機制研究中，通過CRISPR/Cas干擾FOXO3可使患者對重復抗原刺激后的功能障礙產(chǎn)生抵抗，相反，F(xiàn)OXO3過表達顯著減少了4-1BB（而非CD28） CAR T細胞在重復抗原刺激下的擴增。在小鼠異種移植應激模型中，注射極少量的CAR T細胞治療較高的腫瘤負荷，攜帶4-1BB胞內(nèi)信號域的FOXO3敲除CAR T細胞改善了生存。

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值得注意的是，研究人員通過深度技術探究（從高維細胞測定到縱向單細胞RNA測序）發(fā)現(xiàn)了一種新的分子機制，同時仍然使用相對簡單的體外模型（重復抗原刺激）。分子程序本身和FOXO3的重新激活是有趣的，可能在自然界中并不常見。在自然生物學中，4-1BB刺激與T細胞受體（TCR）刺激在時間上分離，而TCR表達本身隨著抗原暴露而循環(huán)，因此減少了緊張信號傳導的可能性。未來的研究可能包括在更多接受Tisagenlecleucel治療但無應答的患者中進一步驗證TBBD轉(zhuǎn)錄特征和FOXO3活性。同樣，無論疾病狀態(tài)如何，我們都應基于對新生CD19+ B細胞的長期暴露，進一步了解Tisagenlecleucel在患者中是否會耗竭。有趣的是，在接受治療的前2例患者（這2例患者均有長期緩解）中，長期暴露于新生B細胞被認為在Tisagenlecleucel持續(xù)10年的過程中發(fā)揮了作用。此外，當BCMA陽性骨髓瘤患者在使用BCMA導向的CAR T細胞持續(xù)存在的情況下復發(fā)時，對于對其他抗原具有特異性的、攜帶4- 1BB的CAR T細胞（例如已批準用于多發(fā)性骨髓瘤的兩種靶向B細胞成熟抗原[BCMA]的CAR T細胞）是否也表現(xiàn)出TBBD標簽和FOXO3再激活，這將是該領域的興趣。最后，在機制水平，研究FOXO3敲除或C-Jun過表達在減少CAR-T細胞耗竭方面是否更有效將是有趣的。

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