間充質(zhì)干細胞(MSCs)是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)中最受關(guān)注的細胞類型之一。

數(shù)千項使用間充質(zhì)干細胞的臨床試驗已經(jīng)完成，許多其他試驗仍在研究中。

對于大多數(shù)治療應(yīng)用，MSC都需要體外培養(yǎng)。然而，體外培養(yǎng)條件并不完全等同在生物體內(nèi)環(huán)境，也就有可能影響到MSCs的生物學(xué)特性，包括它們的再生能力、免疫調(diào)控能力等等。

接下來我們就一起來關(guān)注下這些有可能導(dǎo)致間充質(zhì)干細胞不良事件和功能改變的潛在風(fēng)險。

介紹

大多數(shù)科學(xué)報告展示了細胞療法的積極方面，但是沒有介紹可能影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的不良事件。

然而，重要的是，MSC是具有不同再生特性的異質(zhì)細胞群，這些不同的特性可能影響干細胞治療的最終結(jié)果。

很重要的一個就是MSC的來源和供體的年齡。眾所周知，與年輕人和健康人相比，從老年或患病患者中獲得的MSCs群體是不同的。

同時由于組織中很少存在間充質(zhì)干細胞，體外總是需要培養(yǎng)來獲得足夠的細胞數(shù)從而實現(xiàn)臨床應(yīng)用。在體外培養(yǎng)中，多種非生理條件的影響如氧水平、細胞密度、培養(yǎng)基含量、傳代次數(shù)和增殖衰老，它們一起改變了MSC的方方面面。

MSC在體外培養(yǎng)期間不良事件潛在風(fēng)險計劃

間充質(zhì)干細胞的多樣性

學(xué)界認為，MSC多能性不是細胞治療的關(guān)鍵方面，旁分泌功能是其組織修復(fù)的主要路徑。然而不同來源的MSC，其細胞的外泌體可能不同。

多項研究表明，分離自患病患者的間充質(zhì)干細胞可能會釋放出對再生過程產(chǎn)生負面影響的因子。

間充質(zhì)干細胞的臨床應(yīng)用已經(jīng)實施很多年。

在以往的臨床試驗（特別是西方國家）中，骨髓來源的間充質(zhì)干細胞是最常用的細胞類型，但是由于骨髓組織的抽吸是一個痛苦的有創(chuàng)過程，研究人員一直尋求MSCs的替代來源。

近年來，研究表明，與成人來源相比，新生兒組織具有生物學(xué)優(yōu)勢，這使得它們成為間充質(zhì)干細胞的優(yōu)質(zhì)來源，新生兒間充質(zhì)干細胞比間充質(zhì)干細胞具有更好的增殖能力、更長的壽命和更有效的分化潛能。

然而尚未得到答案的是，是從不同來源獲得的MSCs是否代表不同的群體，是否每一種都具有不同的治療應(yīng)用潛力。

MSC體外擴增期間的潛在風(fēng)險影響治療特性

3D細胞培養(yǎng)

• 體外培養(yǎng)條件

雖然MSCs幾乎存在于所有組織中，但它們在組織中的含量相對較低，大多數(shù)臨床方案推薦單次2000萬到1億細胞量的治療。因此，為了獲得如此高數(shù)量的細胞，必須進行體外擴增。

MSC分離方案依賴于這些細胞粘附到塑料表面的能力，然而，貼壁培養(yǎng)法產(chǎn)生了具有大量祖細胞和其他細胞類型的異質(zhì)干細胞群。另一種方法是使用機械外植法或用膠原酶進行蛋白水解酶處理來分離MSCs，不過這可能會影響細胞的生物學(xué)特性。

最近報道，氧水平也是干細胞生物學(xué)中的一個關(guān)鍵因素。間充質(zhì)干細胞以往的體外培養(yǎng)是處于標準氧濃度(21%)下，研究證實在低氧濃度下培養(yǎng)MSCs可顯著增加細胞壽命，限制了氧化應(yīng)激、DNA損傷、端?？s短和染色體畸變。

另一個應(yīng)該考慮的方面是培養(yǎng)試劑，包括蛋白水解酶、培養(yǎng)基和儲存試劑對擴增的MSCs生物學(xué)特性的影響。培養(yǎng)基中的胎牛血清是有問題的，因為血清中存在的成分和生長因子沒有被很好地表征，用于MSC體外擴增的理想培養(yǎng)基應(yīng)該包含根據(jù)細胞類型確定的標準營養(yǎng)物。

另外，在大多數(shù)情況下，擴增的間充質(zhì)干細胞需要冷凍保存，但是保存條件會改變產(chǎn)品的質(zhì)量。冷凍保存也可以帶來許多不良事件，譬如改變MSC表型和細胞功能。最佳的冷凍和解凍溫度控制、冷凍保存介質(zhì)和在液氮中的長期儲存是應(yīng)該考慮的主要關(guān)鍵因素。

由DMSO組成的冷凍介質(zhì)，盡管對許多類型的細胞有毒性，仍然是最常用的冷凍保存溶液。由于DMSO的毒性，通常需要在移植前進行洗脫。有報道顯示，在輸注預(yù)先冷凍在DMSO中的MSCs后，患者出現(xiàn)短暫的并發(fā)癥，包括頭痛、嘔吐和高血壓或低血壓，其中一些人出現(xiàn)了呼吸和心血管問題。羥乙基淀粉(HES)可能是細胞冷凍保護中DMSO的替代物，然而還需要更多研究。

• 間充質(zhì)干細胞增殖受損

培養(yǎng)的MSCs在體外通常具有高增殖特性。

然而，細胞增殖速率取決于許多因素，即MSCs的來源、細胞所處階段或培養(yǎng)條件。

已有研究表明，與成人來源的間充質(zhì)干細胞相比，新生兒間充質(zhì)干細胞具有更高的增殖潛力。

同樣地，培養(yǎng)條件可以改變MSC的增殖，細胞接種密度可能對MSC生長有影響。Mareschi及其同事評估了初始細胞密度和培養(yǎng)時間對BM-MSCs形態(tài)學(xué)、代謝活性和分化潛能的影響，他們發(fā)現(xiàn)最佳細胞生長發(fā)生在較低的初始培養(yǎng)密度，當(dāng)高細胞接種密度時，會導(dǎo)致扁平細胞數(shù)量增加和細胞低增殖率。

與傳統(tǒng)的二維(2D)培養(yǎng)相比，MSC在三維(3D)結(jié)構(gòu)中的培養(yǎng)可以增加其治療潛力。然而，3D培養(yǎng)的細胞聚集體可以達到很大的尺寸，如果將這種濃縮細胞池注射到組織中可能帶來不良反應(yīng)，譬如肺栓塞或心腦血管梗塞等。此外，3D體中的所有細胞并非都處于相同的分化階段。

就臨床移植而言，去除動物成分的培養(yǎng)基是非常重要的，動物成分即具有病毒傳播以及移植受體免疫系統(tǒng)激活的潛在風(fēng)險的牛血清，自體或同種異體來源的血漿或血小板裂解物代表了比FBS更安全的替代品。Smith團隊優(yōu)化了添加了不同濃度hPL的臍帶來源間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)的GMP擴增方案。他們觀察到在富含10%富血小板血漿(PRP)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞具有最有效的增殖率。不過需要注意的是，研究表明從老年患者獲得的自體血漿降低了MSC的增殖特性。

• 間充質(zhì)干細胞分化不確定

MSC未解決的分化問題可以分為兩個負面影響。一方面，存在MSC不受控制地分化成不想要的細胞的問題，另一方面，存在完全喪失分化潛能的問題。

這個問題可能是由未指定的培養(yǎng)條件引起的，也可能是由于多能間充質(zhì)干細胞可能因干細胞生態(tài)位的不同引發(fā)。

一些報告指出了關(guān)于移植后MSCs自發(fā)分化成未預(yù)知的細胞類型。譬如在小鼠心肌病實驗?zāi)Ｐ椭凶C明了間充質(zhì)干細胞移植到心臟中導(dǎo)致鈣化，在高脂血癥大鼠間充質(zhì)干細胞移植后的腹主動脈損傷部位也觀察到了鈣化現(xiàn)象。它提示醫(yī)學(xué)界，在骨組織以外的組織中注射MSC后可能會發(fā)生骨化過程。

間充質(zhì)干細胞衰老與轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險

與其他類型的細胞類似，間充質(zhì)干細胞存在一定代次的細胞傳代后衰老的情況。

許多論文已經(jīng)證明，MSCs的長期擴增可誘導(dǎo)細胞衰老，這與生長停滯和細胞凋亡以及其“醫(yī)學(xué)”特性的降低有關(guān)。

Ko及其同事已經(jīng)表明，類似于原代組織細胞，臍帶血來源的MSCs (UCB-MSCs)在50次群體倍增(PDs)后啟動細胞分裂的永久停滯。

MSC衰老的過程也取決于MSCs的不同來源，有研究顯示AT-MSCs在第七次群體倍增時出現(xiàn)衰老表型，其特征是細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細胞凋亡增加。

間充質(zhì)干細胞的衰老與其功能衰退密切相關(guān)。這一過程的特征包括在培養(yǎng)中觀察到的表型改變，以及形態(tài)學(xué)改變、端粒長度減少和MSCs免疫特性降低等等。

另外細胞衰老的另一個潛在風(fēng)險是可能的致畸能力，這可能來自高度增殖細胞中隨機突變的積累。米烏拉及其同事已經(jīng)表明，鼠間充質(zhì)干細胞經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，獲得了無限的細胞增殖潛能，并經(jīng)歷了惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致靜脈注射細胞后在多個器官中觀察到纖維肉瘤的形成。在長期培養(yǎng)中產(chǎn)生的這種轉(zhuǎn)化的MSCs表現(xiàn)出累積的染色體異常、增加的端粒酶活性和c-myc表達以及對抗癌藥物更有效的抗性。

這些重要的發(fā)現(xiàn)證實了最大限度地減少和限制體外細胞操作和培養(yǎng)的公知原理。

間充質(zhì)干細胞的標記程序可能會影響其功能

使用外源性MSCs的臨床應(yīng)用的一個重要問題是了解移植細胞在受體組織中的命運。

由于這個原因，細胞標記有助于確定在預(yù)期作用位置移植細胞的狀態(tài)。

適當(dāng)?shù)募毎旧沟媚軌蜓芯客庠葱约毎倪w移途徑及其在受體生物體中的持久性，并允許可視化細胞分化和監(jiān)測移植細胞與宿主組織的整合過程或消除過程。

不幸的是，大部分用于外源細胞標記的方法對干細胞并不友好。

標記MSCs的氧化鐵(SPIO)小顆?？赡軗p害細胞生物學(xué)的幾個方面，即遷移特性和集落形成能力。

在熒光標記領(lǐng)域，細胞標記對MSC生物學(xué)的負面影響的例子更多。Gallina及其同事報道，在熒光二氧化硅納米顆粒(SiO2-NP) MSC標記后，納米顆粒在溶酶體中積累，與未標記的細胞相比，其數(shù)量顯著增加。帶有熒光蛋白編碼基因的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)也可能損害MSC的天然能力，紀等報道GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)表達的MSCs集落形成率低，增殖率不穩(wěn)定。

在其他研究中，在攜帶GFP的MSCs中，MMP-2基因表達增加，這表明攜帶GFP的MSCs顯示出遷移能力的改變。其他類型的熒光染料，即熒光親脂性陽離子吲哚碳菁染料(DiI)或溴脫氧尿苷(BrdU)，明顯導(dǎo)致細胞活力降低。

也有一些證據(jù)表明，放射性標記擾亂了間充質(zhì)干細胞的增殖率。氟脫氧葡萄糖-18F處理后不久，間充質(zhì)干細胞增殖速度減慢。

結(jié)論

在過去的幾年里，干細胞移植作為不同疾病的治療手段已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進展。然而，人們必須意識到，盡管在治療方法中具有巨大的應(yīng)用潛力，但間充質(zhì)干細胞也顯示出許多局限性。

本文列舉了部分與MSC療法相關(guān)的潛在問題和障礙，包括與制造過程和細胞生物學(xué)特性相關(guān)的風(fēng)險。

最令人困擾的問題是分離和擴增間充質(zhì)干細胞的方案在實驗室之間差異很大，這可能會顯著影響干細胞治療的有效性。

因此，制定MSC產(chǎn)品的國際標準至關(guān)重要，這些產(chǎn)品應(yīng)按照良好醫(yī)療規(guī)范(GMP)加工，具有成本效益，臨床實用性。只有到那時，干細胞療法才會成為一種成熟的、被廣泛采用的治療方法。

參考資料：Drela K, Stanaszek L, Nowakowski A, Kuczynska Z, Lukomska B. Experimental Strategies of Mesenchymal Stem Cell Propagation: Adverse Events and Potential Risk of Functional Changes.?Stem Cells Int. 2019;2019:7012692. Published 2019 Mar 6. doi:10.1155/2019/7012692

*內(nèi)容為【干細胞精研社】原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明來源

圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪