今天給同學(xué)們分享一篇共病+網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的生信文章“Exploring the common pathogenesis of Alzheimer’s disease and type 2 diabetes mellitus via microarray data analysis”，這篇文章于2023年2月27日發(fā)表在Front Aging Neurosci期刊上，影響因子為5.738。

阿爾茨海默?。ˋD）和2型糖尿?。―M）在現(xiàn)代社會中的發(fā)病率不斷增加。盡管越來越多的證據(jù)支持DM易患AD，但其相互關(guān)系機制仍未完全闡明。

1. 差異表達基因的鑒定

圖1展示了本文的思想。相關(guān)性分析后，對微陣列結(jié)果進行標(biāo)準化處理（圖2A，B、3A，B）DEG（GSE97760中的8091個和GSE95849中的3004個）（圖2C，D、3C，D）。在排除GSE95849之間在GSE97760中具有相反表達趨勢的基因后，獲得了339個常見的DEG（97個下調(diào)，242個上調(diào)）（圖4A）。在DEGs分析中，GSM527027被視為異常樣本，因此在隨后的分析中刪除了該樣本（圖3A:a1、a2、B:b1、b2）。

圖1 研究設(shè)計流程圖

圖2 AD組的微陣列標(biāo)準化和差異基因分析

圖3 DM組的微陣列標(biāo)準化和差異基因分析

圖4 DEGs富集分析結(jié)果

2. 常見差異表達基因（DEGs）功能特征分析

GO功能和KEGG通路富集分析被用來分析339個共同差異表達基因（附表S1）所涉及的生物功能和通路。GO分析結(jié)果顯示，共有4,236個生物過程（BP），包括3'-UTR介導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定、囊泡組織、細胞分裂過程和星形膠質(zhì)細胞發(fā)育；567個細胞組分（CC），涉及內(nèi)體部分、脂多糖受體復(fù)合物、Wnt信號體和磷脂酰肌醇甘酰轉(zhuǎn)移酶I復(fù)合物；720個分子功能（MF），如肌肉結(jié)構(gòu)成分、Toll樣受體4結(jié)合、脂多糖受體活性和Toll樣受體結(jié)合（圖4B）。KEGG通路包括有機體系統(tǒng)、代謝、環(huán)境信息處理和人類疾病。代謝方面的三個重要富集途徑是糖基生物合成和代謝、輔因子代謝、糖基生物合成和代謝；機體系統(tǒng)中富集了甲狀腺激素合成、卵巢類固醇合成和脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)；環(huán)境信息處理中發(fā)現(xiàn)了MAPK信號通路、cAMP信號通路和Hippo信號通路；人類疾病中包括內(nèi)分泌耐藥性、瘧疾和軍團菌病（圖4C，D)，這些結(jié)果表明，炎癥、激素、細胞因子和糖類共同參與了AD和DM的發(fā)生和發(fā)展。

3. PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和小分子藥物預(yù)測

PPI網(wǎng)絡(luò)包含233個節(jié)點和286個相互作用對（圖5）。將DEGs輸入CMap數(shù)據(jù)庫以通過連接性預(yù)測可能逆轉(zhuǎn)兩種疾病病理的小分子化合物。為了探索這種方法的可行性，作者在Drugbank中搜索了兩種疾病的批準藥物，并獲得了10種AD藥物和52種DM藥物。有趣的是，在CMap的結(jié)果中，有7種AD藥物與得分范圍為-0.9247至-1.3658匹配；同樣，有27種DM藥物與得分范圍為-0.6906至-1.0733匹配。在7,952個負相關(guān)的小分子化合物中，前10個小分子的得分范圍為-1.6824至-1.8921，明顯低于兩種疾病的列出藥物，表明這些小分子具有逆轉(zhuǎn)兩種疾病病理的潛力。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)和常見的DEGs

4. 免疫浸潤分析

檢測微環(huán)境對臨床治療敏感性和疾病診斷具有重要的參考價值。在研究免疫浸潤與基因矩陣之間的關(guān)系后，作者進一步探索了影響這兩種疾病進展的基因的潛在分子機制（圖6）。結(jié)果表明，AD組的單核細胞、NKT細胞、Tr1細胞、iTreg細胞、Tcm細胞和Tem細胞的比例明顯高于普通患者。相比之下，許多細胞的比例低于正?；颊?，如DC細胞、中性粒細胞、nTreg細胞和CD8_navie細胞（圖6A）。然而，在DM組中，免疫浸潤的情況表現(xiàn)不同。與普通患者相比，中性粒細胞在DM組中顯著增加，而單核細胞、iTreg細胞和iTreg細胞顯著減少，其他顯著減少的細胞包括NK細胞、CD4_T細胞、CD8_T細胞、Tgd細胞、CD4_navie細胞、nTreg細胞、Tfh細胞和CD8_naive細胞（圖6B）。以上結(jié)果反映了不同疾病的細胞免疫微環(huán)境的差異。

圖6 免疫浸潤分析

5. 選擇和分析關(guān)鍵基因

根據(jù)cybHubba的九種算法特征，作者分別得到了前30個中心基因（附表S4）。值得注意的是，這些中心基因共享10個靶點，包括七個上調(diào)基因（PTGS2、RAB10、LRRK2、SOS1、EEA1、NF1和RAB14）和三個下調(diào)基因（ADCY5、RAPGEF3、PRKACG）（圖7A）。表1顯示了相關(guān)功能的全名和中心基因?；贕eneMANIA數(shù)據(jù)庫，作者得到了一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中包括59.87%的共表達、31.95%的Reactome、7.09%的物理相互作用和1.10%的通路。GO分析涉及對胰高血糖素的反應(yīng)、對肽激素刺激的細胞反應(yīng)、cAMP代謝過程、胰島素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)、對金屬離子的細胞反應(yīng)以及激活細胞表面受體信號通路的先天免疫反應(yīng)。這些Reactome的結(jié)果強調(diào)了免疫系統(tǒng)和胰島素在AD和DM中的關(guān)鍵作用（圖7B）。此外，使用WebGestalt進行的通路分析與血清素能突觸、卵巢類固醇合成和雌激素信號通路、脂肪細胞中脂解的調(diào)節(jié)以及人類巨細胞病毒感染相關(guān)（圖7D）。有趣的是，兩個基因（ADCY5和PRKACG）幾乎涉及了所有前10個KEGG通路（圖7C）。因此，神經(jīng)遞質(zhì)、胰島素、免疫和性激素在這兩種疾病的發(fā)展中起著重要作用。圖7E顯示了10個中心基因的mRNA表達情況。

圖7 Hub Gene的獲取和共表達網(wǎng)絡(luò)分析

為了探索Hub基因?qū)膊∶庖呓櫟呢暙I，作者進行了相關(guān)性分析。對于AD患者，EEA1、LRRK2、NF1、PTGS2、RAB10、RAB14和SOS1與免疫浸潤評分顯著正相關(guān)，而ADCY5和RAPGEF3與免疫浸潤評分顯著負相關(guān)（圖6C）。而在DM患者中，只有PTGS2與免疫浸潤評分顯著正相關(guān)（圖6D）。

此外，作者建立了具有兩個隱藏層和每個隱藏層中五個神經(jīng)元的多層感知（MLP）網(wǎng)絡(luò)。對于獲得的mlpcla模型，可以使用plotnet函數(shù)可視化模型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。運行程序后，可以獲得圖8所示的圖像。在網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元之間的連接權(quán)重中，正重要性使用紅線表示，負后果使用灰色條紋表示，線的粗細反映了權(quán)重的大?。▓D8A，D)。對于MLP網(wǎng)絡(luò)，可以計算和可視化每個獨立變量對模型預(yù)測結(jié)果的重要性。作者的研究發(fā)現(xiàn)，對于AD分類，最重要的三個正向變量是PRKACG、RAPGEF3和LRRK2。而EEA1、RAB14和NF1是三個負權(quán)重變量。對于DM分類，最重要的三個正向變量是PRKACG、RAPGEF3和RAB14。

圖8 多層感知網(wǎng)絡(luò)分析

類似地，負權(quán)重為NF1、LRRK2、EEA1等（圖8B，E） E.MLP分類器對數(shù)據(jù)集的預(yù)測效果也可以使用混淆矩陣來可視化。如圖8所示，AD和DM的種子可以在混淆矩陣中找到，可以100%正確預(yù)測（圖8C，F(xiàn)）。

有趣的是，在查詢AlzData后，作者發(fā)現(xiàn)RAPGEF3與Aβ和Tau顯著正相關(guān)，而NF1與Aβ和Tau顯著負相關(guān)。此外，作者還使用了Attie實驗室的糖尿病數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ADCY5和SOS1與胰島素和體重顯著正相關(guān)，但與葡萄糖顯著負相關(guān)；相反，PTGS2和EEA1與葡萄糖顯著正相關(guān)，但與胰島素和體重顯著負相關(guān)。累積的流行病學(xué)和生化證據(jù)表明，腦內(nèi)胰島素抵抗導(dǎo)致大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)的基因表達譜發(fā)生改變，暗示了2型糖尿病和阿爾茨海默病之間的關(guān)聯(lián)。GSE34451數(shù)據(jù)集包含了來自2型糖尿病Goto-Kakizaki大鼠和對照動物的每個腦區(qū)樣本的三重復(fù)制品，為最近闡述的阿爾茨海默病是第3型糖尿病的理論提供了進一步的實驗證據(jù)。與正常組相比，海馬中的EEA1、NF1和RAB14顯著上調(diào)。皮質(zhì)中的ADCY5和RAPGEF3顯著下調(diào)，紋狀體中的LRRK2、RAB10和SOS1顯著下調(diào)，NF1顯著上調(diào)。已經(jīng)證明，T2D db/db小鼠在短期和空間工作記憶方面與db/m小鼠相比存在缺陷。使用GSE151294數(shù)據(jù)集對T2D db/db小鼠的海馬組織進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)海馬中的EEA1和LRRK2顯著下調(diào)，而NF1顯著上調(diào)。

上述的驗證結(jié)果與作者的生物信息學(xué)分析結(jié)果有些不同，這可能是由于所測試的物種和對象不同所致。本文研究了DM和AD的人類血液轉(zhuǎn)錄組學(xué)，并使用動物腦組織作為驗證樣本，但最終結(jié)果對作者是有利的。例如，在血液中，NF1、RAB14、ADCY5和RAPGEF3的mRNA表達趨勢與腦病相同，這表明通過檢測與血液相關(guān)的指標(biāo)可以實現(xiàn)評估腦狀態(tài)的目的。

圖9 預(yù)測和驗證轉(zhuǎn)錄因子

基于iRegulon作者發(fā)現(xiàn)10個轉(zhuǎn)錄因子（NES ≥ 5）可能調(diào)控中心基因的表達（圖9A）。進一步驗證表明，CEBPD，E2F6和FOXO4在DM組中顯著上調(diào)，而KDM4A和HOXB7顯著下調(diào)。類似地，CNOT4在AD組中顯著上調(diào)，但FOXO4顯著下調(diào)。它們共同調(diào)控著10個中心基因（圖9B）。

圖10 通過生物信息學(xué)分析探索與DM并發(fā)AD的發(fā)病機制相關(guān)的中心基因

總結(jié)

總之，作者探討了AD和DM可能的差異表達基因（DEGs），并進行了常規(guī)的生物信息學(xué)分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。正如作者所預(yù)期的那樣，AD和DM共同貢獻了各種常見的致病機制，這可能是由個體中心基因自愿發(fā)生的。葡萄糖穩(wěn)態(tài)和腦功能的變化，NF1、RAB14、ADCY5和RAPGEF3可能成為后續(xù)研究的重點。迄今為止，關(guān)鍵基因與AD和DM的免疫浸潤之間的聯(lián)系很少被報道。關(guān)鍵基因是否具有臨床診斷意義，以及與免疫浸潤相關(guān)的因素是否有助于AD或DM的診斷，仍有待探索。本研究為繼續(xù)探索DM伴隨AD或其他疾病的分子機制提出了一個新的概念。