Noninvasive proteomic biomarkers for?alcohol-related liver disease

研究對(duì)象：酒精相關(guān)肝病（ALD）臨床病人、健康人

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時(shí)間：2022.06

影響因子：87.241/Q1

技術(shù)策略：DIA蛋白質(zhì)組學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)模型

發(fā)表單位：馬克斯·普朗克生物化學(xué)研究所

DOI：10.1038/s41591-022-01850-y

研究背景

酒精相關(guān)肝?。ˋLD）是常見的慢性肝病，經(jīng)常導(dǎo)致肝硬化。隨著發(fā)病率上升，已成為肝移植的主要適應(yīng)癥。脂肪變性、酒精性肝臟炎癥和纖維化是明顯的組織病理學(xué)特征，標(biāo)志著ALD向肝硬化的發(fā)展，然而這種發(fā)展往往是無癥狀和非特異性的，ALD患者在發(fā)生肝硬化后才被診斷，導(dǎo)致錯(cuò)過了最佳治療階段，這使得早期診斷極具挑戰(zhàn)性?，F(xiàn)有的非侵入性生物標(biāo)志物在疾病早期診斷的準(zhǔn)確性有限。因此，迫切需要微創(chuàng)診斷策略來篩查高危人群中的患者。

本篇文章通過在現(xiàn)有大規(guī)模臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DIA血漿蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物組合檢測(cè)肝損傷，并探索其作為肝病臨床診斷和預(yù)后工具的潛力，揭示關(guān)于ALD病理生理并為新的治療方案提供見解。

樣本策略

1、ALD患者篩選隊(duì)列（GALA–ALD，n=459例血液，其中79例為組織-血漿配對(duì)患者）；

2、健康對(duì)照隊(duì)列（GALA–HP，n=137例血液）；

3、ALD篩查驗(yàn)證隊(duì)列（GALA–ALD，n=63例血液）

技術(shù)流程

文章通過數(shù)據(jù)非依賴性采集質(zhì)譜技術(shù)（DIA-MS）對(duì)GALA-ALD隊(duì)列中459例ALD患者的血漿樣本和79份肝組織分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并結(jié)合血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和機(jī)器學(xué)習(xí)，構(gòu)建了用于檢測(cè)早期纖維化（F2）、炎癥（I2）和脂肪變性（S0）的預(yù)測(cè)模型。最后在獨(dú)立的驗(yàn)證隊(duì)列得到了證實(shí)。

結(jié)果速遞

肝臟病變對(duì)肝臟和血漿蛋白組的影響

基于DIA-MS的肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)總共鑒定出5515個(gè)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)717種與三種疾病脂肪變性、纖維化、脂肪肝炎相關(guān)的差異蛋白，其中68種在脂肪變性階段顯著失調(diào)，135種和658種分別在炎癥活動(dòng)階段和纖維化階段顯著失調(diào)（FDR<0.05），纖維化對(duì)肝臟蛋白質(zhì)組的影響最大，其次是炎癥，84%炎癥失調(diào)的蛋白也在纖維化過程失調(diào)。作者根據(jù)人類蛋白質(zhì)圖譜中的注釋對(duì)失調(diào)蛋白進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化進(jìn)展的增加“肝臟特異性”蛋白有87%出現(xiàn)下調(diào)，80%注釋為“分泌”的蛋白質(zhì)被上調(diào)，這也與作者以往關(guān)于非酒精性脂肪肝（NAFLD）和肝硬化的研究報(bào)道相似。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在三類排名前20?的相關(guān)蛋白中，與纖維化階段最相關(guān)的主要是肝臟的分泌蛋白。與炎癥相關(guān)的蛋白中有50%是細(xì)胞骨架蛋白，表明肝臟炎癥會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。與脂肪變性相關(guān)的蛋白中，PLIN2和FABP4以往被認(rèn)為是NAFLD患者NAFLD47患者從單純脂肪變性變向非酒精性脂肪肝炎的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

血漿蛋白質(zhì)組檢測(cè)發(fā)現(xiàn)225種蛋白質(zhì)在纖維化的組織學(xué)階段（206種蛋白質(zhì)）、炎癥活性（163種蛋白質(zhì)）和脂肪變性（48種蛋白質(zhì)）中有顯著差異，其中，隨著纖維化階段的增加，134種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，91種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。在這些被注釋為“肝臟特異性”或“分泌”的失調(diào)蛋白質(zhì)中，分別有83%和64%被發(fā)現(xiàn)下調(diào)。ALD患者Reactome通路分析表明血漿含量下調(diào)的蛋白包括補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血因子、載脂蛋白和載體蛋白等。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，分別有106/55/5種蛋白與纖維化/炎癥活動(dòng)/脂肪變性相關(guān)，其中補(bǔ)體成分C7、QSOX1和LGALS3BP與纖維化程度相關(guān)性最高，具有纖維化和炎癥標(biāo)志物潛力，同時(shí)，與ALD脂肪變性相關(guān)性排第二的ALDOB也是NAFLD的潛在生物標(biāo)志物。

肝臟與血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)整合

研究人員對(duì)肝臟和血漿中共同測(cè)定的420種蛋白質(zhì)進(jìn)行了整合分析，結(jié)果顯示在二維空間呈現(xiàn)兩簇?！皩?duì)角簇”表明這組蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度在肝臟與血漿中很大程度是相關(guān)的，而“垂直簇”蛋白組則表明其在肝臟和血漿中的相對(duì)豐度相關(guān)性較弱。有112種蛋白的相對(duì)豐度在成對(duì)的肝臟和血漿樣本中顯著相關(guān)，例如其中C7和IgA1的r值高達(dá)0.85，作為心血管疾病的系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物的CRP在肝組織和循環(huán)中的水平高度相關(guān)（r = 0.73）。共有46個(gè)蛋白在肝臟和血漿蛋白組中均存在顯著差異，主要參與免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附、ECM組織、蛋白酶抑制劑和細(xì)胞內(nèi)酶。大多數(shù)蛋白隨著纖維化進(jìn)展（F0-F4）在血漿和組織中逐漸上調(diào)，少數(shù)蛋白在組織和血漿中表達(dá)不一致，推測(cè)可能是因?yàn)檠獫{水平是反映組織滲漏和肝臟合成受損的綜合結(jié)果。

ALD?早期病理學(xué)的生物標(biāo)志物

在標(biāo)志物的篩選方面，研究人員首先比較了22種最先進(jìn)的機(jī)器學(xué)習(xí)分類器并確定了邏輯回歸模型作為最終分類器，作者選定了三組標(biāo)志物分別用于表征區(qū)分顯著肝纖維化（9種蛋白質(zhì)）、輕度炎癥活動(dòng)（6種蛋白質(zhì)）和肝脂肪變性（12種蛋白質(zhì)）。在包含三組標(biāo)志物的22個(gè)蛋白中，有8種在血漿和肝臟中受到協(xié)同調(diào)節(jié)，包括?C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN?和?SERPINF1。邏輯回歸模型的平均交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，三組蛋白標(biāo)志物組合模型對(duì)于顯著纖維化、輕度炎癥活性和任何脂肪變性的平均ROC-AUC分別為0.90、0.85和0.91，具有良好的診斷效能。與15種最先進(jìn)的臨床測(cè)試模型相比，蛋白質(zhì)組學(xué)模型具有最高的F1分?jǐn)?shù)和平衡準(zhǔn)確性。

獨(dú)立隊(duì)列驗(yàn)證模型性能和預(yù)后性能

健康對(duì)照組中，使用蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建的模型能夠正確地排除隊(duì)列中的顯著纖維化（≥F2）、晚期纖維化（≥ F3）和輕度炎癥（≥ I2）準(zhǔn)確率分別是99%、100%和98%，其中15%的健康個(gè)體被歸類為脂肪變性陽(yáng)性，是由于他們的BMI指數(shù)與GALA–ALD隊(duì)列相一致。對(duì)于有酒精濫用史且因肝硬度低而未進(jìn)行活檢的患者集（n = 97），該模型排除顯著和晚期纖維化的準(zhǔn)確率分別是93%和100%。

接下來，作者使用了獨(dú)立ALD驗(yàn)證隊(duì)列（n = 63）驗(yàn)證模型性能，模型產(chǎn)生的ROC–AUC分別為0.87和0.81，顯著纖維化和輕度炎癥的模型效能高于其他同類模型。

最后作者對(duì)GALA–ALD隊(duì)列中457名患者從納入之日起至死亡或隨訪期結(jié)束（53個(gè)月）的縱向臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行采集并定義了肝臟相關(guān)事件和全因死亡率事件，將蛋白質(zhì)組學(xué)模型與其他商業(yè)生物標(biāo)志物和肝纖維化的組織學(xué)分期進(jìn)行比較，此模型對(duì)患者肝臟相關(guān)事件具有最高的判別準(zhǔn)確率（Harrell'sC??= 0.900?，3年和5年AUC分別是?0.945和0.933）；對(duì)于全因死亡率，蛋白組學(xué)模型的表現(xiàn)最好（Harrell's?C??= 0.789、3?年和?5?年?AUC?分別是?0.836?和?0.818）。綜上所述，這項(xiàng)研究構(gòu)建的蛋白質(zhì)組學(xué)模型是準(zhǔn)確的預(yù)后指標(biāo)。

作者利用ALD患者，健康對(duì)照和ALD獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列的肝臟和血液DIA蛋白組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)肝臟生理病例相關(guān)的肝臟和血漿均發(fā)生顯著的蛋白質(zhì)組重塑現(xiàn)象。首次利用基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)模型確定三組蛋白生物標(biāo)志物組合準(zhǔn)確檢測(cè)ALD中的纖維化、炎癥和脂肪變性三種疾病，并在獨(dú)立測(cè)試集中得到了驗(yàn)證。最后結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了模型對(duì)于肝臟相關(guān)事件和全因死亡率的預(yù)后性能高，為臨床診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療提供可靠依據(jù)。