一、摘要

原代組織是目前生物醫(yī)學(xué)相關(guān)科研領(lǐng)域重要的樣本來(lái)源，對(duì)其需進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)降解和單細(xì)胞分離，包括組織解剖、機(jī)械解離和酶消化三個(gè)重要步驟，并希望得到更高的回收率和活力，以應(yīng)用于后續(xù)的流式或單細(xì)胞測(cè)序等分析。

1>>制備單細(xì)胞懸浮液的要求

1）快速

2）高活力

3）最少細(xì)胞碎片或聚集體

4）最大程度保持細(xì)胞表面抗原不被破壞

2>>制備單細(xì)胞懸浮液的基本步驟包括

A.切碎增加起始固體組織材料的表面積，以使組織和消化酶之間的接觸最大化

B.通過(guò)酶來(lái)消化細(xì)胞外基質(zhì)

C.切割細(xì)胞 - 細(xì)胞連接

二、組織的組成

一個(gè)完整的組織包括胞外基質(zhì)，細(xì)胞和細(xì)胞膜表面的連接物將細(xì)胞和細(xì)胞之間互相鉚定。

1>>細(xì)胞外基質(zhì)

在整個(gè)生物體中，所有組織和器官都由被稱為細(xì)胞外基質(zhì)的非細(xì)胞成分包圍的細(xì)胞組成。細(xì)胞外基質(zhì)的功能是為組織提供支架和結(jié)構(gòu)支持，同時(shí)還在每個(gè)特定組織內(nèi)啟動(dòng)生物化學(xué)和生物力學(xué)提示。細(xì)胞外基質(zhì)由屬于三大類生物分子的成分組成：膠原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白。

1）膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最豐富的纖維蛋白。因此，膠原蛋白是該基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)元素，提供拉伸強(qiáng)度和調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附。膠原蛋白還通過(guò)支持趨化性和遷移同時(shí)指導(dǎo)組織發(fā)育來(lái)響應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)中的生化信號(hào)。

2）蛋白多糖是由與糖胺聚糖鏈結(jié)合的以蛋白質(zhì)為核心組成的生物分子。蛋白多糖在細(xì)胞外基質(zhì)中的作用包括組織基質(zhì)組裝，調(diào)節(jié)組織中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)，以及激活細(xì)胞表面受體以影響細(xì)胞和整個(gè)器官的功能和發(fā)育。在組織中發(fā)現(xiàn)的常見(jiàn)類型的蛋白多糖包括核心蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖和透明質(zhì)酸。核心蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖存在于整個(gè)生物體的所有組織中。在大多數(shù)組織中發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸作為結(jié)構(gòu)組分和信號(hào)分子，但缺乏通常指示蛋白多糖的蛋白質(zhì)核心。許多其他類型的蛋白聚糖僅存在于整個(gè)生物體的特定組織類型中，本文不再進(jìn)行評(píng)述。

3）糖蛋白是由與碳水化合物基團(tuán)連接的多肽鏈組成的任何蛋白質(zhì)。在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種常見(jiàn)糖蛋白是纖連蛋白，其通過(guò)與膠原蛋白，血小板反應(yīng)蛋白，整聯(lián)蛋白，纖維蛋白和糖胺聚糖結(jié)合而發(fā)揮結(jié)構(gòu)作用。通過(guò)積極調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞在粘附，分化，遷移，表型穩(wěn)定性和細(xì)胞凋亡抗性方面的行為，層粘連蛋白也有助于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。彈性蛋白是組織細(xì)胞外基質(zhì)中彈性纖維的主要成分，是這些纖維彈性的主要貢獻(xiàn)者。彈性蛋白通常存在于皮膚，肺，韌帶，肌腱和血管組織中。通常在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的其他糖蛋白包括纖維蛋白原，原纖蛋白，纖維蛋白，肌腱蛋白，血小板反應(yīng)蛋白和軟骨寡聚復(fù)合蛋白。

2>>細(xì)胞膜

細(xì)胞膜是磷脂雙層，其作為圍繞細(xì)胞的疏水屏障，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部及其細(xì)胞器。細(xì)胞膜含有各種膜蛋白，這些蛋白在細(xì)胞的發(fā)育和存活中至關(guān)重要。受體蛋白促進(jìn)信號(hào)穿過(guò)細(xì)胞膜的傳遞，使細(xì)胞能夠響應(yīng)其環(huán)境中的線索，而嵌入細(xì)胞膜的通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠通過(guò)主動(dòng)和被動(dòng)過(guò)程使特定離子進(jìn)入或離開(kāi)細(xì)胞。

酶蛋白也存在于整個(gè)細(xì)胞膜中，催化細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍的化學(xué)反應(yīng)。消化酶的選擇和濃度對(duì)于從固體組織制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行流式分析至關(guān)重要，因?yàn)榧?xì)胞表面受體或膜蛋白可被酶（如胰蛋白酶）的蛋白水解活性切割，在免疫表型分析實(shí)驗(yàn)中可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。

3>>細(xì)胞 - 細(xì)胞連接

細(xì)胞 - 細(xì)胞連接是組織的主要結(jié)構(gòu)和功能組分，必須將其切割以制備單細(xì)胞懸液，用于流式分析。與制備單細(xì)胞懸浮液相關(guān)的三種主要類型的細(xì)胞 - 細(xì)胞連接是（i）封閉連接，（ii）連通連接，和（iii）錨定連接。封閉連接，通常稱為緊密連接，在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的頂點(diǎn)附近保持連續(xù)的周向密封。這些連接點(diǎn)表現(xiàn)為與鄰近細(xì)胞的細(xì)胞膜明顯融合的一系列離散位點(diǎn)。緊密連接存在結(jié)構(gòu)變異，由跨膜蛋白組成，包括密蛋白，連接粘附分子家族蛋白，閉合蛋白，粘連蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞選擇性粘附分子。緊密連接的功能是形成屏障，該屏障可以控制水和溶質(zhì)在細(xì)胞旁空間的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)還保持整個(gè)細(xì)胞膜中存在的離子通道，泵和載體蛋白的分布。通信連接通常稱為間隙連接，其功能是允許相鄰細(xì)胞之間的代謝物和離子的細(xì)胞質(zhì)交換。這些間隙連接由無(wú)脊椎動(dòng)物中的無(wú)脊椎連接蛋白和脊椎動(dòng)物中的連接蛋白組成，其中六種連接蛋白結(jié)合形成一個(gè)連接子。錨定連接包括粘附連接，橋粒和半橋粒，其作用是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞粘附并轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。錨定連接由鈣粘蛋白組成，形成拉鏈狀結(jié)構(gòu)，使相鄰細(xì)胞在組織內(nèi)穩(wěn)定粘附。

三、組織解離

1>>切碎組織

在從生物體中解剖出固體組織后，在引入消化酶之前，應(yīng)沖洗組織以清除任何血液或其他不需要的物質(zhì)。然后將組織切碎并用剪刀，手術(shù)刀或刀片分散，以增加總表面積。這增加了酶與組織表面之間的接觸，導(dǎo)致更有效和完全的消化，同時(shí)縮短了消化所需的時(shí)間。

2>>酶

組織將細(xì)胞保持在一起，由細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞 - 細(xì)胞連接點(diǎn)支持，這些細(xì)胞連接由多種蛋白質(zhì)和其他生物分子組成，這些分子需要特定的酶來(lái)適當(dāng)消化并從細(xì)胞懸浮液中除去。

第一類酶：分解細(xì)胞外基質(zhì)的酶1）分散酶(Dispase)是從細(xì)菌中分離的常用中性蛋白酶，對(duì)膠原蛋白IV和纖連蛋白具有高水平的酶特異性。分散酶可用于細(xì)胞集落的分離和組織塊分解成小塊細(xì)胞，因?yàn)樗梢郧懈罴?xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的附著物，而不會(huì)影響細(xì)胞 - 細(xì)胞連接。然而，在用分散酶消化組織時(shí)應(yīng)該小心，因?yàn)樗軌蚯懈钐囟ǖ南嚓P(guān)表面分子或抗原，例如與T細(xì)胞分析相關(guān)的標(biāo)記。因此，如果觀察到表位缺失，則從消化緩沖液中省略分散可能是有幫助的。
2）膠原酶能夠破壞膠原蛋白中存在的肽鍵，有助于消化細(xì)胞外基質(zhì)，使細(xì)胞釋放到懸浮液中。重要的是要注意純化的膠原酶比天然來(lái)自細(xì)菌的傳統(tǒng)膠原酶更有效，因?yàn)榧兓傅慕M成變化較小，增加了整個(gè)組織消化過(guò)程中細(xì)胞的穩(wěn)定性。
3）透明質(zhì)酸酶，細(xì)胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白多糖，可被在細(xì)菌和脊椎動(dòng)物生物體中產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶酶家族降解。這些透明質(zhì)酸酶切割透明質(zhì)酸的糖胺聚糖部分中存在的β1,4-糖苷鍵，有助于細(xì)胞外基質(zhì)的消化。
第二類酶：破壞細(xì)胞 - 細(xì)胞連接的酶1）胰蛋白酶是在脊椎動(dòng)物有機(jī)體的消化系統(tǒng)中合成的天然蛋白酶?？捎糜诮到饧?xì)胞 - 細(xì)胞連接中存在的某些蛋白質(zhì)，但缺點(diǎn)是破壞細(xì)胞膜蛋白；也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而出現(xiàn)游離DNA誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集。常不用胰蛋白酶制備來(lái)自固體組織的單細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)。
2）木瓜蛋白酶是來(lái)自木瓜植物的替代蛋白酶。已知木瓜蛋白酶降解構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的蛋白質(zhì)。然而，與胰蛋白酶一樣，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而出現(xiàn)游離DNA誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集。
第三類酶：脫氧核糖核酸酶（DNase），用于切割DNA骨架的磷酸二酯鍵
1）DNase的兩種主要類型是DNase-1和DNase-II，它們具有略微不同的酶功能。DNase-II不適合制備單細(xì)胞懸液，因?yàn)樗诘蛲鲋袇⑴c吞噬介導(dǎo)的DNA降解途徑。2）DNase-I適用于組織消化和單細(xì)胞懸浮液的制備，降解由死細(xì)胞裂解釋放的游離DNA而不引發(fā)凋亡，來(lái)防止細(xì)胞聚集。氯化鈣（CaCl2）充當(dāng)DNase-1的酶活化劑，因此在酶消化過(guò)程中被引入消化混合物中。鈣離子（Ca2 +）與DNase-I酶緊密結(jié)合，以穩(wěn)定其活性構(gòu)象，并允許游離DNA的正常降解。
第四類：開(kāi)發(fā)并優(yōu)化的商品化產(chǎn)品1）Accutase是一種蛋白酶和膠原酶混合物，模仿胰蛋白酶和膠原酶的作用，但其濃度遠(yuǎn)低于使用標(biāo)準(zhǔn)酶時(shí)所需的濃度。Accutase含有具有蛋白水解，膠原水解和DNase活性的酶的混合物，與使用類似酶的混合物進(jìn)行組織消化相比，產(chǎn)生更高的總細(xì)胞產(chǎn)量和改善的總抗原保存。2）TrypLE是另一種酶混合物，含有純化的重組酶，模擬胰蛋白酶的活性而不改變細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。該產(chǎn)品避免了胰蛋白酶在組織消化中使用時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題，并且改善細(xì)胞存活和更有效的單細(xì)胞懸浮液制備。

3>>酶和機(jī)械解離基于所使用的酶混合物，通過(guò)將消化混合物引入切碎的固體組織并在特定溫度下孵育來(lái)進(jìn)行酶解離。酶可以是溫度特異性的，因此在給定溫度下以最高速度和效率工作，通常為37℃，也可以在4℃或冰上進(jìn)行，取決于特定的酶。較低的溫度可能會(huì)降低酶的反應(yīng)速度并延長(zhǎng)酶解時(shí)間，但可以幫助減少細(xì)胞死亡。當(dāng)選擇消化混合物用于制備用于流式分析的單細(xì)胞懸液時(shí)，酶強(qiáng)度和酶濃度是兩個(gè)最重要的考慮因素。具有高強(qiáng)度或高濃度的酶可能損害細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物，這可能影響這些標(biāo)志物的可用性和細(xì)胞在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中的活力。因此，應(yīng)使用溫和的酶、短消化時(shí)間來(lái)分離輕度貼壁細(xì)胞如淋巴細(xì)胞。確定用于酶促解離的酶的最佳強(qiáng)度和濃度對(duì)于細(xì)胞的適當(dāng)分離和組織的成功消化是經(jīng)驗(yàn)性的和關(guān)鍵的。在整個(gè)酶促解離過(guò)程中，需機(jī)械解離輔助。在軌道振蕩器上進(jìn)行酶消化有助于細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)釋放到懸浮液中。在酶促解離后，應(yīng)過(guò)濾懸浮液以排除未消化的組織塊或聚集體。

四、評(píng)估單個(gè)細(xì)胞懸浮液

評(píng)估從固體組織獲得的單細(xì)胞懸浮液的質(zhì)量是流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)之前需采取的重要步驟。評(píng)估固體組織的酶促和機(jī)械解離后的三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)（i）細(xì)胞活力（ii）細(xì)胞碎片

（iii）聚集體

使用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活力排除測(cè)定法可以輕松測(cè)定單細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞活力，其中死細(xì)胞將臺(tái)盼藍(lán)吸收到其細(xì)胞質(zhì)中，而活細(xì)胞保留其選擇性滲透膜并防止臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。然后可以使用光學(xué)顯微鏡評(píng)估單細(xì)胞懸浮液中活細(xì)胞和死細(xì)胞的相對(duì)量。還可以使用光學(xué)顯微鏡快速評(píng)估細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集體。也強(qiáng)烈建議在流式細(xì)胞儀上評(píng)估單細(xì)胞制備質(zhì)量，核染色DRAQ5將區(qū)分完整細(xì)胞與細(xì)胞碎片，活力染料PI將允許定量死細(xì)胞的百分比。

五、去除細(xì)胞碎片和死細(xì)胞

將組織處理成單細(xì)胞懸浮液的過(guò)程中，有些細(xì)胞會(huì)自然死亡或由酶促和機(jī)械解離引起的損傷而死亡。高細(xì)胞活力應(yīng)該是每次組織消化的重要目標(biāo)，可使用商品化試劑盒來(lái)去除細(xì)胞碎片和死細(xì)胞。這些試劑盒可從Miltenyi Biotec Inc.（Auburn，CA）和STEMCELL Technologies Inc.（Cambridge，MA）等供應(yīng)商處獲得，是使用磁珠和特異性結(jié)合緩沖液來(lái)標(biāo)記細(xì)胞碎片，死細(xì)胞或垂死細(xì)胞，通過(guò)磁分離負(fù)選的方式僅保留活細(xì)胞。

六、單細(xì)胞懸浮液的冷凍保存

涉及功能測(cè)定的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在制備單細(xì)胞懸液后不久或在冷凍保存的活細(xì)胞上進(jìn)行。
1>>應(yīng)測(cè)試?yán)鋬霰４鎸?duì)細(xì)胞活力和功能的潛在影響

2>>多聚甲醛的溫和固定：

? a.對(duì)一定時(shí)間后分析的樣品，避免在冷凍保存期間改變抗原的表達(dá)或存在。? b.固定可能會(huì)改變蛋白質(zhì)構(gòu)象影響抗原性，需評(píng)估抗體識(shí)別是否會(huì)改變。? c.固定保持細(xì)胞的物理穩(wěn)定，同時(shí)防止新死細(xì)胞的碎裂。? d.保留異質(zhì)細(xì)胞群重要的光散射特性，并有助于防止細(xì)胞粘在一起或粘在染色時(shí)使用的板或管壁上。對(duì)脆性/異質(zhì)性群體如肺單細(xì)胞尤其重要。? e.應(yīng)在固定前對(duì)細(xì)胞染色如FVS系列的活/死染料，以便在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中區(qū)分這兩種群體。

七、總結(jié)影響因素

相關(guān)處理過(guò)程：

1）與從新鮮組織中分離細(xì)胞相比，冷凍組織會(huì)降低總細(xì)胞回收率。表3中肺組織在解剖后和消化之前在-80℃下儲(chǔ)存72小時(shí)，顯示細(xì)胞回收率降低和細(xì)胞活力降低。因此，在可能的情況下，從新鮮組織中分離和處理細(xì)胞是最佳實(shí)踐。

2）使用組織勻漿器的強(qiáng)力機(jī)械解離不適合制備單細(xì)胞懸浮液，因?yàn)樗炊a(chǎn)生細(xì)胞和組織成分的肉湯，可用于分離蛋白質(zhì)用于其他分析方法。當(dāng)使用該方法時(shí)，細(xì)胞活力或完整性遭到破壞，應(yīng)避免使用組織勻漿器獲得單細(xì)胞懸浮液。表3中的數(shù)據(jù)顯示使用組織勻漿器代替切碎組織導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量和活力降低。

3）細(xì)胞碎片在離心過(guò)程中會(huì)因?yàn)閼腋≡谏锨逡褐斜晃邅G棄，和實(shí)際含量產(chǎn)生有較大偏差，尤其是針對(duì)組織勻漿的樣本。

4）渦旋細(xì)胞是另一種強(qiáng)有力的細(xì)胞處理形式，必須避免這種形式以保持單細(xì)胞懸浮液的活力并防止細(xì)胞崩解。在表3中概述的實(shí)驗(yàn)中，渦旋細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞活力降低和細(xì)胞碎片和聚集物增加。不使用渦旋，優(yōu)選輕輕吸打以重懸細(xì)胞或細(xì)胞沉淀，移液吸打時(shí)盡量避免氣泡的產(chǎn)生。

5）離心是另一個(gè)會(huì)導(dǎo)致固體組織單細(xì)胞懸液制備不良結(jié)果的因素。通常，細(xì)胞應(yīng)在300-900相對(duì)離心力（RCF）之間離心，900 RCF更適合固定細(xì)胞，較低的離心力用于活的未固定細(xì)胞。重要的是要注意，這些值以相對(duì)離心力而不是每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（RPM）表示，因?yàn)镽PM表示取決于每個(gè)特定離心機(jī)上的轉(zhuǎn)子半徑的可變力。以過(guò)高的速度離心細(xì)胞可導(dǎo)致聚集體的產(chǎn)生和對(duì)細(xì)胞膜的損傷，而以過(guò)低的速度離心將使細(xì)胞保持懸浮并在吸出上清液時(shí)丟失。

6）表3中，消化不夠的處理?xiàng)l件是在消化混合物中孵育20min，顯示聚集體和細(xì)胞碎片增加；過(guò)度消化是孵育5hr，導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低以及懸浮液中細(xì)胞碎片增加。因此，確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)中涉及的特定消化酶和組織的正確孵育時(shí)間至關(guān)重要。

7）如果可能，應(yīng)將未固定的細(xì)胞在冰上染色以保持活力并避免在免疫染色過(guò)程中細(xì)胞死亡。

8）在整個(gè)消化過(guò)程中，所有緩沖液都應(yīng)含有DNase-I，以降解裂解細(xì)胞釋放的游離DNA，防止細(xì)胞聚集。

9）乙二胺四乙酸（EDTA）是一種螯合劑，可螯合包括整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附所必需的那些二價(jià)金屬離子。因此，在消化混合物中包括EDTA對(duì)于限制天然粘附細(xì)胞如上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附是重要的。

10）材料選擇也在限制粘附方面起作用。由于細(xì)胞和聚丙烯表面之間的親和力較低，聚丙烯管或板最適合于制備單細(xì)胞懸浮液，從而減少了細(xì)胞粘附到管或板上并從懸浮液中丟失的可能性。聚苯乙烯旨在促進(jìn)細(xì)胞粘附和擴(kuò)散，在流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)中應(yīng)避免使用。

11）在嘗試獲取和分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)之前，檢查細(xì)胞活力并評(píng)估單細(xì)胞懸液的總細(xì)胞產(chǎn)量以及細(xì)胞碎片和聚集體的清除是非常重要的。為此目的采用核染色（DRAQ5）和細(xì)胞活力染色（PI）。

12）如果細(xì)胞懸浮液被過(guò)量的紅細(xì)胞污染，應(yīng)使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，并確保懸浮液中保留感興趣的細(xì)胞類型用于免疫染色和流式細(xì)胞儀采集。對(duì)應(yīng)的處理流程應(yīng)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中的所有樣品，以保持細(xì)胞制備程序一致。

所有實(shí)驗(yàn)均使用年齡和性別匹配的小鼠的左肺葉進(jìn)行。針對(duì)每種條件顯示三次實(shí)驗(yàn)的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。（*）表示與Best Practice相比p <0.05（t-檢驗(yàn)）。將聚集物定量為每100nl體積的計(jì)數(shù)（1平方英寸的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器室，0.1mm深度）?；厥章实挠?jì)算為（完整細(xì)胞數(shù)）/（最佳實(shí)踐完整細(xì)胞數(shù)）* 100%。

應(yīng)用相關(guān)注意點(diǎn)：
1.表型分析時(shí)，應(yīng)檢驗(yàn)研究關(guān)注的抗原是否會(huì)被機(jī)械和酶解所破壞，因?yàn)橐恍┟缚梢愿淖兣c表型分析相關(guān)的一些標(biāo)志物的表達(dá)。2. 對(duì)于涉及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)，建議蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑阻斷細(xì)胞因子的分泌。3.組織解離也已經(jīng)顯示出對(duì)RNA表達(dá)的影響，部分原因是microRNA的上調(diào)，當(dāng)細(xì)胞從其周圍組織中分離時(shí)，microRNA在限制細(xì)胞活性中發(fā)揮作用。在評(píng)估RNA表達(dá)之前，應(yīng)考慮這種變化，還應(yīng)在各緩沖液中包括RNase抑制劑以避免感興趣的RNA轉(zhuǎn)錄物的降解。4.流式磷酸化研究旨在通過(guò)研究激酶信號(hào)通路來(lái)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。對(duì)于這些研究，磷酸酶抑制劑應(yīng)包括在酶解混合物中，以保持磷酸化信號(hào)并確保準(zhǔn)確的結(jié)果。5.最后，受損細(xì)胞可釋放能夠切割目的表位的蛋白酶。當(dāng)添加到消化混合物中時(shí)，蛋白酶抑制劑能夠減輕這種表位缺失。

附：小鼠肺單細(xì)胞懸液制備最佳實(shí)踐

1. ?從C57BL/6小鼠收獲肺并從周圍組織中分離。

2. ?用PBS沖洗肺并用剪刀切碎機(jī)械分散，增加酶解面積。

3. ?每個(gè)肺加入2.5ml消化緩沖液，包含100mg/ml Dispase II（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，Cat＃04942078001），10mg/ml膠原酶A（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，Cat＃10103578001），1500kU/ml DNase I（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat＃D5025-150KU）和0.025M CaCl2。

4. ?在軌道振蕩器上于37℃溫育1hr。

5. ?使用移液管輕輕混合懸浮液，并進(jìn)一步溫育30min。

6. ?40μm過(guò)濾器過(guò)濾到50ml Falcon管中。

7. ?使用Beckman Coulter，Allegra X-12R離心機(jī)將懸浮液以900g離心5min，并吸出上清液。

8. ?將沉淀重懸浮于UV活/死染料（Invitrogen，Waltham，MA，Cat＃L23105）中，并在室溫下避光孵育30min。

9. ?將PBS加入懸浮液中，以900g離心5min，吸出上清液。

10.將細(xì)胞在含4％多聚甲醛（Polysciences，Warrington，PA，Cat＃18814-10）的PBS中的中固定10min（10ml 16％PFA稀釋于30ml PBS中）。

11.直接免疫染色或冷凍保存用于以后的抗體染色。

Reference:?Andrew Reichard,1 Kewal Asosingh1,2* Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry ? Cytometry Part A 2018

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