線粒體堪稱生命活動的“能量供給站”，這種存在于大多數(shù)細(xì)胞中的細(xì)胞器，擁有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，除了為細(xì)胞供能之外，線粒體還參與到多種細(xì)胞功能過程中，擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。 典型的動物線粒體是一個環(huán)狀的雙鏈DNA，有些動物的線粒體也會裂化（嚙總目，虱目）；基因組一般比較小，常見的在15-16 kb左右，基因間隔區(qū)小，所有的基因都不含有內(nèi)含子，有重疊基因。在組分構(gòu)成上一般含13個蛋白，2個rRNAs，22個tRNAs，在3’端有一段控制區(qū)。

圖 動物線粒體基因組圈圖

植物線粒體是線粒體基因組研究中難度最高的，大小差異較大，100kb-10Mb，大部分由非編碼DNA序列組成，且有許多同源序列，占基因組總長的2%-60%，基因間區(qū)大，組裝和注釋的難度較高，結(jié)構(gòu)變異大。目前報道的植物線粒體基因組絕大多數(shù)以環(huán)形表示，其包含了所代表物種線粒體的所有遺傳信息，被定義為主環(huán)。

圖 植物線粒體基因組圈圖

凌恩生物有自主研發(fā)的細(xì)胞器提取技術(shù)，提取經(jīng)驗豐富。有專業(yè)團(tuán)隊負(fù)責(zé)跟進(jìn)每一個項目，從細(xì)胞器DNA制備、Hiseq建庫及測序、后續(xù)生物信息分析，直至為客戶提供滿意的結(jié)果。

本期主要介紹線粒體基因組高級分析內(nèi)容。

1、共線性分析

共線性是指遺傳學(xué)中的基因連鎖關(guān)系，是不同物種染色體上同源基因以相同順序排列的現(xiàn)象。兩個物種之間的共線性程度可以作為衡量他們之間進(jìn)化距離的尺度，可以知道物種間的親緣關(guān)系。對基因組間的局部共線性塊進(jìn)行相似度、重排、倒置等現(xiàn)象的分析可以來闡述物種演化中發(fā)生的事件。

圖1 共線性分析

2、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogenetic tree）又稱為系統(tǒng)進(jìn)化樹，是用一種類似樹狀分支的圖形來概括各物種之間的親緣關(guān)系，可用來描述物種之間的進(jìn)化關(guān)系。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可以找出不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，理解祖先序列與其后代之間的關(guān)系，同時也可以估算一組共有共同祖先的物種間的分歧時間。 細(xì)胞器基因組非常保守，常用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹來研究動植物的物種分類和進(jìn)化地位。凌恩生物構(gòu)建細(xì)胞器系統(tǒng)發(fā)生樹的方法有以下兩種： （1）基于樣品與參考基因組的群體SNP矩陣構(gòu)建進(jìn)化樹：對于每一個樣本，按照相同順序?qū)⑺蠸NP相連，獲得相同長度的fasta格式的序列（其中一個為參考序列），作為輸入文件用于進(jìn)化樹構(gòu)建。 （2）基于Core基因構(gòu)建進(jìn)化樹：對細(xì)胞器基因組鑒定出來的單拷貝Core基因，利用MUSCLE v3.8.31軟件進(jìn)行蛋白多序列的比對，比對結(jié)果用于進(jìn)化樹構(gòu)建。

圖2 13個PCG氨基酸系統(tǒng)發(fā)育分析[1]

3、選擇壓力分析

選擇壓力是指外界施加給某物種生物進(jìn)化過程中的壓力，使得物種適應(yīng)自然環(huán)境。在遺傳學(xué)中，ω= Ka/Ks或者dN/dS表示的是非同義突變（Ka）和同義突變（Ks）之間的比率。一般認(rèn)為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。通常認(rèn)為，ω > 1表明有正選擇（Positive Selection）效應(yīng)，即有些有利突變正受到選擇；ω = 1不受選擇，即中性進(jìn)化（Neutral Evolution）；如果0 < ω < 1，則認(rèn)為有純化選擇（Negative or Purifying Selection）作用，ω值越小，說明受到的負(fù)選擇壓越大，氨基酸序列越保守。

圖3 非同義（dN）與同義（dS）核苷酸替換率的比率

[1]

4、細(xì)胞器與核基因組片段交流分析

高等植物線粒體和葉綠體之間的片段交流是非常常見的情況，不同物種的線粒體基因組大概會有5%-10%可以在葉綠體基因組找到同源序列。該分析對于探討葉綠體基因組中水平基因轉(zhuǎn)移的機制以及在植物進(jìn)化中所起的作用具有重要的意義。 此外，植物線粒體基因組和細(xì)胞核基因組之間也存在廣泛的DNA交換。線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)的一些重復(fù)序列可能來源于同一質(zhì)體片段的多次轉(zhuǎn)移。

圖4 細(xì)胞器（線粒體與葉綠體）片段交流分析

圖5 線粒體基因組和核基因組之間共享的相似序列[2]

5、結(jié)構(gòu)變異檢測

細(xì)胞器基因組進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異檢測主要有三種：SNP、InDel和SV。與參考基因組比對，分析近源物種細(xì)胞器基因組之間的變異情況，能夠更好的對個體或群體進(jìn)行差異性分析。 SNP（單核苷酸多態(tài)性）是指由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在編碼基因內(nèi)，也有可能在非編碼序列上，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（coding SNP，cSNP）因其可能影響個體的功能而備受關(guān)注。 InDel是DNA序列的插入（Insertion）和缺失（Deletion）現(xiàn)象的總稱，狹義的InDel表示1~10bp的短InDel。在基因組編碼區(qū)域，InDel的發(fā)生可能會引起移碼突變、氨基酸改變、假基因的出現(xiàn)等等現(xiàn)象。這里分析的是狹義的InDel。 基因組結(jié)構(gòu)變異（SV，Structural Variation）通常是指基因組內(nèi)DNA片段缺失、插入、重復(fù)、倒位、異位。使用MUMmer軟件對目標(biāo)基因組和參考基因組進(jìn)行比對，再使用LASTZ對區(qū)域間進(jìn)行比對，從區(qū)域比對結(jié)果中查找SV。

圖6 全基因組結(jié)構(gòu)變異類型配對圖

6、基因組多態(tài)性分析

核苷酸多態(tài)性（Pi）是衡量特定群體多態(tài)性高低的參數(shù)，是指在同一群體中隨機挑選的兩條DNA序列在各個核首酸位點上核昔酸差異的均值。核苷酸多態(tài)性（Pi）能揭示不同物種核酸序列的變異大小，變異度較高的區(qū)域可以為種群遺傳學(xué)提供潛在的分子標(biāo)記。例：基因和基因間區(qū)的核苷酸多樣性分析。

圖7 線粒體基因組的核苷酸多態(tài)性分析[1]

7、共有基因和特有基因分析

所有樣本中都存在的同源基因稱為“共有基因”（core gene），去掉共有基因后得到的為非共有基因（Dispensable gene），特有基因（specific gene）為只有該樣本特異擁有的基因。共有基因和特有基因很有可能與樣品的共性和特性相對應(yīng)，可以作為樣本間功能差異的研究依據(jù)。

圖8 Core-Pan基因稀釋曲線

圖9 基因組的共有/特有基因數(shù)

8、密碼子偏好性分析

某一特定密碼子在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子中的相對概率，可以反應(yīng)密碼子的偏好性程度。通過計算Relative synonymous codon usage（RSCU）獲得密碼子的偏好性值。研究密碼子的使用模式，對于探明物種進(jìn)化壓力以及進(jìn)一步的遺傳研究都有重要的意義。

圖10 密碼子偏好性分析[3]

9、簡單重復(fù)序列SSR分析

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）又稱作微衛(wèi)星序列（microsatellite, MS），是一類由1-6個核苷酸為基本單位多次重復(fù)而形成的DNA片段。SSR數(shù)量豐富、多態(tài)性高、均勻覆蓋整個基因組、呈共顯性遺傳且檢測簡單，因此被作為第二代分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位、遺傳多樣性研究、分子輔助育種、種質(zhì)資源鑒定等領(lǐng)域。

圖11 SSR分類圖

10、重復(fù)序列分析

重復(fù)序列是發(fā)展群體和進(jìn)化分析標(biāo)記的重要信息來源，串聯(lián)、SSR和長重復(fù)廣泛存在于線粒體基因組中。植物線粒體基因組中的重復(fù)序列對分子間重組至關(guān)重要，分子間重組可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變異和極端線粒體基因組大小。其中散在重復(fù)又稱為長重復(fù)序列，分為：正向重復(fù)（forward repeat）、反向重復(fù)（reverse repeat）、回文重復(fù)（palindromic repeat）和互補重復(fù)（complement repeat）四種類型。

圖12 重復(fù)序列分類圖[4]

11、tRNA二級結(jié)構(gòu)分析

tRNA是破譯mRNAs中遺傳密碼和蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵分子。tRNA通常由76核苷酸組成，排列在類似三葉草的二級結(jié)構(gòu)中，包含3個莖環(huán)，稱為D環(huán)(含二氫尿苷環(huán))、反密碼子環(huán)和T環(huán)（胸苷、假尿苷和含胞苷或TΨC環(huán)）。

圖13 多線南蜥t(yī)RNAs結(jié)構(gòu)預(yù)測[3]

12、RNA編輯分析

線粒體基因表達(dá)需要經(jīng)過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后加工過程，包括RNA C-U編輯、內(nèi)含子剪接、5’和3’末端成熟和RNA穩(wěn)定。RNA編輯廣泛存在于植物細(xì)胞器（線粒體和葉綠體）中，是植物生長發(fā)育所必需的。RNA編輯可以廣泛定義為RNA序列中任何可能從模板中復(fù)制的位點特異性改變。

圖14 RNA編輯[4]

參考文獻(xiàn)

[1]?First description of the mitogenome and phylogeny: Aedes vexansand Ochlerotatus caspius?of the Tribe Aedini (Diptera: Culicidae). Infection, Genetics and Evolution, 2022. [2]?Characterisation of the complete mitochondrial genome of Taraxacum mongolicumrevealed five repeat‐mediated recombinations. Plant Cell Reports, 2023. [3] Characterization of the complete mitochondrial genome of the many-lined sun skink（Eutropis multifasciata）and comparison with other Scincomorpha species. Genomics, 2021. [4] Assembly and comparative analysis of the frst complete mitochondrial genome of Acer truncatum Bunge: a woody oil-tree species producing nervonic acid. BMC Plant Biology, 2022.