腫瘤免疫作為國自然熱點，近兩年發(fā)了這么多生信文章，不想再啃老套路了，還能從哪個角度突圍呢？

免疫細(xì)胞療法！

CAR-T細(xì)胞或CAR-NK細(xì)胞在腫瘤中的研究是非?；馃岬模覀兙蛷呐R床高需求問題入手去打這場腫瘤免疫突圍戰(zhàn)！下面小云就用文章實例展示下具體操作~ 文章由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院的馬長春教授團隊發(fā)表，首先

從腫瘤臨床迫在眉睫的問題入手

（食管癌中適用于基于CAR治療的腫瘤表面抗原的數(shù)量有限），研究腫瘤表面抗原CD22作為CAR-NK細(xì)胞治療的潛在靶點的可行性。

選題上瞄準(zhǔn)“CAR-NK細(xì)胞”大熱點，目前這個方向在生信領(lǐng)域的發(fā)文比較少，發(fā)文空間還是非常大滴，所以創(chuàng)新性和臨床意義都拉滿了；再者利用生信分析與實驗相結(jié)合的方法串聯(lián)起來一個完美的證據(jù)鏈，僅用4張圖就發(fā)到了7分+的文章上，效果非常贊！

學(xué)會這個思路，換個癌種還能復(fù)制，關(guān)注腫瘤免疫方向的小伙伴行動起來~

題目：CD22是CAR-NK細(xì)胞治療食管鱗狀細(xì)胞癌的潛在靶點

雜志：J Transl Med.

影響因子：IF=7.4

發(fā)表時間：2023年10月

研究背景

嵌合抗原受體NK (CAR-NK)細(xì)胞療法是最有前途的免疫療法之一。雖然它在血液惡性腫瘤中顯示出顯著的治療效果，但在包括食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)在內(nèi)的實體瘤中很少獲得成功，主要原因是缺乏特異性細(xì)胞表面抗原和復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)CD22，一種眾所周知的血液惡性腫瘤的腫瘤表面標(biāo)記物，在ESCC表達(dá)，可能作為CAR-NK細(xì)胞治療的潛在靶點。

研究流程

作者首先收集了臨床使用的13種腫瘤細(xì)胞表面抗原，在TCGA隊列中分析其表達(dá)，然后在2個ESCC細(xì)胞系和自有隊列的2個患者樣品中通過qPCR檢測以上13個基因的表達(dá)，將3個來源的差異基因取交集后，選擇CD22作為目標(biāo)基因。隨后，分別用免疫熒光法(IF)和免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測了87例ESCC樣本中CD22的表達(dá)，并計算H-score。此外，作者在TCGA隊列和自有隊列中利用KM曲線分析CD22表達(dá)與OS預(yù)后的相關(guān)性。最后，通過實時細(xì)胞分析儀(RTCA)平臺研究CD22靶向的CAR-NK細(xì)胞對ESCC細(xì)胞系的抗腫瘤活性。 ?

主要結(jié)果

1. 通過聯(lián)合篩選策略識別CD22作為潛在靶標(biāo)

基于當(dāng)前在臨床試驗中的使用，作者選擇了十三個靶標(biāo)（CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD44、ROR1、PSCA、FAP、GPC3、EGFR、MET、MUC1和MUC16），首先在TCGA-ESCC隊列中分析其表達(dá)（圖1A），然后在2個自有隊列患者的癌和癌旁組織（圖1B）以及2個在2個ESCC細(xì)胞系(KYSE140，KYSE150)中通過qPCR檢測以上13個基因的表達(dá)（圖1C）。將3個來源的差異表達(dá)基因取交集，獲得2個共享基因（CD44和CD22），由于研究人員已經(jīng)報道CD44在ESCC的腫瘤起始細(xì)胞中高表達(dá)，所以本研究選擇CD22作為潛在靶標(biāo)進行后續(xù)研究。作者隨后通過免疫熒光檢測再次驗證KYSE140和KYSE150細(xì)胞中CD22的表達(dá)，結(jié)果顯示可以在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)CD22（圖1E）。

圖1?CD22的篩選和表達(dá)驗證

2. CD22在ESCC患者組織標(biāo)本中的表達(dá)驗證

作者通過IHC分析了自有隊列中87例ESCC患者的CD22表達(dá)，由于CD22被廣泛認(rèn)為是B細(xì)胞的標(biāo)志，所以本研究用PBS孵育的扁桃體癌切片用作陰性對照（圖2A），使用富含B細(xì)胞的扁桃體癌作為陽性對照，染色結(jié)果顯示CD22在扁桃體癌淋巴結(jié)中強表達(dá)（圖2B）。對ESCC患者的染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞膜中的CD22表達(dá)明顯（圖2C），在第二個患者中CD22主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖2D)，而在某些情況下，在基質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)CD22陽性淋巴細(xì)胞(圖2E)。隨后根據(jù)IHC結(jié)果對87名ESCC患者的組織切片進行了H評分，0分表示在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)陰性或很少(圖2F)，1分代表弱陽性表達(dá)(圖2G)，2代表中度陽性(圖2H)，3代表高度陽性表達(dá)(圖2I)。

圖2?CD22在ESCC患者組織標(biāo)本中的表達(dá)驗證

3. CD22表達(dá)與總生存率的相關(guān)性分析

作者基于TCGA-ESCC隊列，利用KM曲線分析CD22的表達(dá)與OS的相關(guān)性，顯示CD22表達(dá)與TCGA患者的總生存率無關(guān)（圖3A）。同時也在自有隊列的87名ESCC患者中進行KM生存分析，以H評分代表CD22表達(dá)評估其與OS的相關(guān)性，結(jié)果顯示，CD22陽性患者的OS與CD22陰性患者的OS無顯著差異（圖3B）。

圖3 CD22表達(dá)與OS的相關(guān)性分析

4. CD22靶向CAR-NK細(xì)胞的體外抗腫瘤活性研究

作者首先利用流式細(xì)胞儀進一步分析了KYSE140和KYSE150細(xì)胞中CD22的表達(dá)，證實了CD22的膜表達(dá)（圖4A）。作者先從iPS細(xì)胞中誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生，并驗證它們對K562細(xì)胞系的殺傷能力，結(jié)果顯示，iPS-NK細(xì)胞的殺傷率隨著iPS-NK細(xì)胞數(shù)量的增加而增加（圖4B）。隨后作者構(gòu)建了CD22-CAR，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到iPS細(xì)胞中，然后誘導(dǎo)CD22-CAR-iPS細(xì)胞分化為CD22-CAR-NK細(xì)胞。流式細(xì)胞儀顯示CD22的單鏈可變片段在CD22-CAR-NK細(xì)胞中高度表達(dá)，但在iPS-NK細(xì)胞中不表達(dá)(圖4C,D)。同時，CD22-CAR-NK細(xì)胞也表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)記物(圖4E)。最后，將工程化的CD22-CAR-NK細(xì)胞分別與兩種ESCC細(xì)胞系共培養(yǎng)，通過xCELLigence系統(tǒng)觀察殺傷作用。結(jié)果顯示，與iPS-NK細(xì)胞相比，CD22-CAR-NK細(xì)胞顯示出更高的細(xì)胞毒性（圖4F,G）。

圖4 CD22靶向CAR-NK細(xì)胞的體外抗腫瘤活性研究

文章小結(jié)

看完這篇文章思路有沒有覺得腫瘤免疫方向的研究還有很多可做之處？文章從臨床高需求問題入手，選擇明星熱點“CAR-NK細(xì)胞療法”，選題創(chuàng)新性滿滿，并且相當(dāng)貼近臨床更容易獲得審稿人的青睞，同時利用生信+實驗相結(jié)合的方法，既可以省一定的時間和經(jīng)費，又可以豐富文章，加強靶點選擇的證據(jù)性，所以直接4張圖拿下了7分+的文章，效果不得不說很贊?。∠朐谀[瘤免疫方向做點新東西的小伙伴，不要錯過這個好思路，可以換個癌種復(fù)現(xiàn)，還可以拓展做國自然課題，一舉兩得~