Development and Validation of a TNF Family-Based Signature for Predicting Prognosis, Tumor Immune Characteristics, and Immunotherapy Response in Colorectal Cancer Patients

摘要：

在這項(xiàng)研究中，對結(jié)直腸癌 (CRC) 中的 TNF 家族成員進(jìn)行了全面分析，并生成了基于 TNF 家族的特征 (TFS) 來預(yù)測預(yù)后和免疫治療反應(yīng)。使用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中516例CRC患者的表達(dá)數(shù)據(jù)，采用單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸和最小絕對收縮和選擇算子-（LASSO-）Cox比例篩選TNF家族成員構(gòu)建TFS。危害回歸法。然后在元基因表達(dá)綜合 (GEO) 隊(duì)列中驗(yàn)證 TFS (?n= 1162) 來自 GEO 數(shù)據(jù)庫。此外，分析了基于 TFS 的風(fēng)險(xiǎn)亞組中的腫瘤免疫特征和對免疫檢查點(diǎn)阻斷的預(yù)測反應(yīng)。八個(gè)基因（TNFRSF11A、TNFRSF10C、TNFRSF10B、TNFSF11、TNFRSF25、TNFRSF19、LTBR 和 NGFR）用于構(gòu)建 TFS。與高?；颊呦啾?，低危患者的總生存期更好，這一點(diǎn)得到了 GEO 數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。此外，高 TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分與調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs)、非活化巨噬細(xì)胞 (M0)、自然殺傷細(xì)胞、免疫逃逸表型、免疫治療反應(yīng)差以及致瘤和轉(zhuǎn)移相關(guān)途徑的高浸潤有關(guān)。相反，低 TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分與靜息 CD4 記憶 T 細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞的高浸潤有關(guān)，免疫逃逸表型很少，對免疫治療的敏感性高。因此，基于 8 個(gè)基因的 TFS 是預(yù)測 CRC 預(yù)后、免疫特征和免疫治療反應(yīng)的有希望的指標(biāo)，我們的結(jié)果也為 TNF 家族成員在 CRC 預(yù)后和治療中的作用提供了新的認(rèn)識(shí)。

結(jié)果

CRC中預(yù)后TNF家族基因的鑒定

評估了 47 個(gè)定義明確的 TNF 家族基因，包括 18 個(gè) TNFSF 成員和 29 個(gè) TNFRSF 成員。首先，對 TCGA 隊(duì)列中 516 例 CRC 病例的 TNF 家族基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。這些 CRC 患者的臨床特征列于表格1.?9 個(gè)基因被確定為與 OS 顯著相關(guān)（P?< 0.1）（表 2）。在這9個(gè)基因中，風(fēng)險(xiǎn)比> 1的4個(gè)（TNFRSF25、TNFRSF19、LTBR和NGFR）被確定為危險(xiǎn)因素，而風(fēng)險(xiǎn)比<1的其他5個(gè)（TNFRSF11A、TNFRSF10C、TNFRSF10B、TNFSF11和FAS）被確定為危險(xiǎn)因素。被確定為保護(hù)因素。

使用 TCGA 隊(duì)列中的 CRC 患者建立 TFS

為了建立最佳 TFS（風(fēng)險(xiǎn)模型），對九個(gè)基因進(jìn)行 LASSO-Cox 回歸分析（圖1)，這導(dǎo)致建立了涉及 8 個(gè) TNF 家族成員的以下公式：TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分 = (-0.1344 × TNFRSF10B 表達(dá)) + (0.2647 × LTBR 表達(dá)) + (-0.1953 × TNFRSF10C 表達(dá)) + (0.1843 × TNFSF11 表達(dá)) + (0.1764 × TNFRSF19 表達(dá)) + (0.0916 × NGFR 表達(dá)) + (-0.1395 × TNFRSF11A 表達(dá)) + (0.1387 × TNFRSF25 表達(dá)) (圖1）。此后，根據(jù)上述公式計(jì)算每位患者的 TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分。計(jì)算出最佳截止值 (1.72)，隨后將患者分為高風(fēng)險(xiǎn) (?n?= 246) 和低風(fēng)險(xiǎn) (?n?= 270) 亞組。TCGA 隊(duì)列中 CRC 患者的基因表達(dá)譜、TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分和生存狀態(tài)顯示在圖 2(a).

Kaplan-Meier 生存分析顯示高危組的 OS 較低（圖 2(b)P?< 0.00001) 低于低風(fēng)險(xiǎn)組。接下來，計(jì)算受試者工作特征 (AUC-ROC) 曲線值下的時(shí)間相關(guān)面積，以評估 TFS 預(yù)測 TCGA 隊(duì)列中 1 年、3 年和 5 年 OS 的能力。這些值分別為 0.704、0.703 和 0.665（圖 2(c)）。由于早期（I 期和 II 期）和晚期（III 和 IV 期）CRC 的治療策略和預(yù)后存在顯著差異，因此 TFS 被進(jìn)一步應(yīng)用于這些不同的臨床階段。高危組晚期患者的 OS 比低危組差（圖 2(e))（對數(shù)秩檢驗(yàn)，P?< 0.0001）

在四個(gè)獨(dú)立隊(duì)列和 Meta-GEO 隊(duì)列中驗(yàn)證 TFS

為了評估八基因 TFS 的預(yù)后穩(wěn)健性，使用相同的風(fēng)險(xiǎn)公式進(jìn)一步評估其在四個(gè)獨(dú)立 GEO 數(shù)據(jù)集（GSE17536、GSE39582、GSE17537和GSE87211）和元 GEO 隊(duì)列中的表現(xiàn)。根據(jù)最佳 TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分截止值，驗(yàn)證隊(duì)列中的患者被分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Meta-GEO 隊(duì)列中 TFS 中 8 個(gè)基因的 mRNA 表達(dá)、生存狀態(tài)和 TFS 風(fēng)險(xiǎn)評分顯示在圖 3(a).?正如預(yù)期的那樣，Kaplan-Meier 結(jié)果顯示，在GSE17536數(shù)據(jù)集中，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)患者的 OS 更差（截止值 = -0.43；對數(shù)秩檢驗(yàn)，P?= 0.0121）（圖 3(c)），在GSE39582數(shù)據(jù)集中（截止值 = -0.2；對數(shù)秩檢驗(yàn)，P?= 0.2372）（圖 3(d)), 在GSE17537數(shù)據(jù)集中 (cutoff = 0; log-rank test,?P?= 0.0169) (圖 3(e))，并且在GSE87211數(shù)據(jù)集中 (cutoff = -0.02; log-rank test,?P?= 0.3026) (圖 3(f)）。由于上述四個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集中的兩個(gè)P > 0.05，因此在元 GEO CRC 隊(duì)列中進(jìn)一步評估了 TFS 的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果表明，TFS 對 CRC 患者具有較高的預(yù)測能力（截止值 = -0.2；對數(shù)秩檢驗(yàn)，P?< 0.001）（圖 3(b)）。

評估高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群的免疫細(xì)胞浸潤和 TME

為了評估與兩個(gè) TFS 風(fēng)險(xiǎn)亞組相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤，對 TCGA 隊(duì)列中的每個(gè) CRC 病例使用 CIBERSORT 和 LM22 來評估 22 個(gè)免疫細(xì)胞的比例。圖 4(a)）。低風(fēng)險(xiǎn)組的靜息 CD4 記憶 T 細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞浸潤較高，而調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs)、非活化巨噬細(xì)胞 (M0)、活化自然殺傷 (NK) 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤較高高危組 (?P?< 0.001) (圖 4(b)）。此外，采用 ESTIMATE 算法評估低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組 CRC 患者的 ESTIMATE 評分、基質(zhì)評分、免疫評分和腫瘤純度的差異。我們發(fā)現(xiàn) TFS 與 ESTIMATE 評分和免疫評分呈負(fù)相關(guān)，而 TFS 與基質(zhì)評分和腫瘤純度

TFS 與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)

由于 TFS 成功預(yù)測了 CRC 患者的 OS 率，我們進(jìn)一步研究了其對免疫治療反應(yīng)的預(yù)測能力。

首先，TFS與免疫檢查點(diǎn)蛋白的相關(guān)性分析，包括CTLA4、PD-1、PD-L1、淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白和基于免疫受體酪氨酸的抑制基序結(jié)構(gòu)域（TIGIT），和 T 細(xì)胞免疫球蛋白 3 (TIM-3)，在 TCGA 數(shù)據(jù)集中的 516 名 CRC 患者中進(jìn)行。TFS 與這些免疫檢查點(diǎn)蛋白呈負(fù)相關(guān)（P?< 0.01），但 LAG-3 與 TFS 無關(guān)（P?> 0.05）（圖5(c)?和?5(d)）。

此后，應(yīng)用 TIDE 算法來預(yù)測對 ICB 的反應(yīng)。有趣的是，高風(fēng)險(xiǎn)組的 TIDE 評分、T 細(xì)胞功能障礙 (Dysfunction)、T 細(xì)胞排斥 (Exclusion) 和髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 的值顯著更高。相比之下，高危組的干擾素-γ (IFNG)、MSI 評分、Merck18、CD274 和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 M2 值顯著降低（Mann-Whitney?U檢驗(yàn)P?< 0.001）（圖5(a)?和?5(b)）。最后，我們分析了高危和低危患者腫瘤突變負(fù)荷（TMB）的差異，未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖 5(e)）。

高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)群體之間的DEG的功能豐富性分析

根據(jù)log2絕對值（倍數(shù)變化（FC））≥1和FDR <0.05的標(biāo)準(zhǔn)，在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間確定了127個(gè)DEG。其中，高危組74個(gè)基因上調(diào)（log2FC>1），53個(gè)基因下調(diào)（log2FC<1）。隨后，對 127 個(gè) DEGs 進(jìn)行 GO 和 KEGG 分析，以進(jìn)一步了解與這些基因相關(guān)的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。GO分析表明，DEGs主要富集于以下GO生物學(xué)過程：消化系統(tǒng)發(fā)育、O-聚糖加工、激素代謝過程和白細(xì)胞趨化性調(diào)節(jié)。DEGs的GO分子功能包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、受體配體活性、粒細(xì)胞趨化性的正調(diào)節(jié)、和生長因子活性。主要富集的 GO 細(xì)胞成分是膜的錨定成分（圖 6(b)）。KEGG 通路分析表明，DEGs 與過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR)、磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K-) Akt、白細(xì)胞介素- (IL-) 17、Wnt 信號(hào)通路和細(xì)胞外基質(zhì)- (ECM- ）受體相互作用，已被證實(shí)與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)（圖 6(c)) [?22?–?26?]。這些生物學(xué)功能和途徑可能有助于 DEG 在 CRC 發(fā)展中的作用。

基于 TFS 的列線圖

為了評估 TFS 是否可以獨(dú)立預(yù)測 CRC 預(yù)后，對傳統(tǒng)的臨床重要因素和八基因 TFS 進(jìn)行了單變量和多變量 Cox 回歸分析。根據(jù)單變量 Cox 回歸，年齡、腫瘤、淋巴結(jié)、轉(zhuǎn)移 (TNM) 分期和 TFS 與較差的 OS 顯著相關(guān)。圖 7(a)）。隨后的多變量 Cox 回歸顯示，TNM 分期和 TFS 都是 TCGA 隊(duì)列中 CRC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素。圖 7(b)）。為了在臨床實(shí)踐中提供預(yù)測 CRC 患者預(yù)后的定量工具，構(gòu)建了一個(gè)整合了 8 基因 TFS 和 TNM 分期的列線圖。圖 7(c)）。此外，列線圖的校準(zhǔn)曲線表明它對預(yù)測患者的 1 年、3 年和 5 年 OS 具有良好的效果（圖7(d)–7(f)）。

討論

據(jù)我們所知，這是第一次構(gòu)建 TFS 來預(yù)測 CRC 患者的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)。使用單變量 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析和 LASSO-Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，確定了 CRC 的八基因 TFS，并使用 GEO 數(shù)據(jù)對其進(jìn)行了驗(yàn)證。TFS 被發(fā)現(xiàn)是 CRC 患者 OS 差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。我們還研究了高危和低?；颊叩拿庖咛卣?，發(fā)現(xiàn) TFS 與各種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞密切相關(guān)。此外，TFS 與幾種免疫治療反應(yīng)生物標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，包括 PD-L1、PD-1、CTLA4、TIGIT 和 TIM-3。這表明腫瘤免疫逃逸可能導(dǎo)致高危CRC患者的不良預(yù)后。

系統(tǒng)分析了CRC患者中TNF家族成員的基因表達(dá)譜。結(jié)果，8個(gè)基因（TNFRSF10B、LTBR、TNFRSF10C、TNFSF11、TNFRSF19、NGFR、TNFRSF11A和TNFRSF25）用于建立TFS。TNFRSF10B（也稱為 DR5 或 TRAILR2）是一種屬于 TNFRSF 家族的蛋白質(zhì)，可介導(dǎo)各種癌細(xì)胞的外在凋亡途徑 [?27?]。最近的研究表明，這種蛋白質(zhì)在人類 CRC 細(xì)胞中的上調(diào)提高了癌癥治療的效率 [?28?–?30?]。淋巴毒素-β 受體（LT?β?R 或 LTBR）是 TNFRSF 家族的成員，它可能參與促進(jìn) CRC 的細(xì)胞增殖[?31]。TNFRSF10C屬于TNFRSF家族，可與TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體樣（TRAIL）結(jié)合，抑制細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路。此外，這種蛋白質(zhì)的下調(diào)會(huì)加重遠(yuǎn)處 CRC 轉(zhuǎn)移 [?32?]。TNFRSF19（也稱為 TROY）是 TNFRSF 家族的成員，在原發(fā)性 CRC 中上調(diào)，導(dǎo)致 CRC 的發(fā)生或進(jìn)展 [?33?]。NGFR 屬于 TNFRSF 家族，已被證明直接或間接參與 CRC 的發(fā)展和轉(zhuǎn)移 [?34?]。盡管 TNFSF25、TNFRSF11A 和 TNFRSF11 的預(yù)后價(jià)值之前尚未在 CRC 中進(jìn)行過研究，但它們?nèi)杂锌赡苡米餍碌纳飿?biāo)志物。

最近，TME 中的腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞因其在調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展和預(yù)測癌癥結(jié)果方面的重要作用而受到越來越多的關(guān)注 [?35?]。在這項(xiàng)研究中，進(jìn)行了免疫細(xì)胞浸潤分析以比較低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之間的炎癥狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)高危 CRC 患者的 Treg 細(xì)胞、非活化巨噬細(xì)胞 (M0) 和 NK 細(xì)胞比例較高。Treg 細(xì)胞是 CD4+ T 細(xì)胞的一種亞型，對維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并參與腫瘤免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展 [?36]。同樣，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是 TME 的重要組成部分，通過促進(jìn)免疫逃逸在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用 [?37?]。盡管 NK 細(xì)胞被認(rèn)為是先天免疫和腫瘤免疫監(jiān)視中的主要效應(yīng)細(xì)胞 [?38?]，但 NK 細(xì)胞的高浸潤與某些腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)，這可能是因?yàn)槟[瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞細(xì)胞損害其功能 [?39?,?40?]。

此外，我們調(diào)查了基于 TFS 的風(fēng)險(xiǎn)亞組與幾種免疫治療反應(yīng)生物標(biāo)志物之間的關(guān)聯(lián)，包括免疫檢查點(diǎn)蛋白和 TIDE 評分。正如預(yù)期的那樣，高危 CRC 患者的 PD-L1、PD-1、CTLA4、TIGIT 和 TIM-3 表達(dá)普遍較低。結(jié)果表明，高?；颊邔?ICB 的反應(yīng)可能較差 [?41?]。TIDE 評分作為預(yù)測 ICB 反應(yīng)的傳統(tǒng)單一生物標(biāo)志物的有效替代品。較高的 TIDE 評分不僅表明腫瘤具有免疫逃逸表型，而且還預(yù)示著癌癥患者對 ICB 的反應(yīng)較差 [?21?]。此外，IFNG、MSI 評分和 CD274 值的增加表明對 ICB 的反應(yīng)良好 [?42]。我們發(fā)現(xiàn)高危組 CRC 患者的 TIDE 評分、T 細(xì)胞功能障礙和 T 細(xì)胞排斥為陽性，而 IFNG、MSI 評分和 CD274 為陰性。綜上所述，這些結(jié)果表明高危CRC患者預(yù)后不良是由于腫瘤免疫逃避和對ICB反應(yīng)差，這有助于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

免疫評分總結(jié)了侵襲邊緣和腫瘤核心處 CD3+ 和 CD8+ T 細(xì)胞效應(yīng)物的密度 [?43?]。據(jù)報(bào)道，它在預(yù)測 CRC [?44?] 中的 OS 方面優(yōu)于 TNM 分類。先前的研究報(bào)道，與免疫評分低的患者相比，免疫評分高的 CRC 患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)最低且 OS 更好 [?43?,?45?]。因此，我們的結(jié)果表明，高危組患者的免疫評分較低，這進(jìn)一步驗(yàn)證了 TFS 的可靠性。

然而，該研究有一些需要注意的局限性。首先，本研究中的數(shù)據(jù)來自 TCGA 和 GEO 數(shù)據(jù)庫，結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行臨床驗(yàn)證，以評估 TFS 在臨床環(huán)境中預(yù)測 CRC 患者預(yù)后的穩(wěn)健性。其次，沒有評估 TFS 對具有各種臨床特征（如高脂飲食、飲酒、焦慮和抑郁）的患者的預(yù)測能力。然而，這些因素有助于 CRC 的發(fā)生和進(jìn)展以及患者的不同預(yù)后 [?46?,?47?]。第三，由于沒有來自接受免疫治療的患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，需要前瞻性研究來確認(rèn) TFS 預(yù)測免疫治療反應(yīng)的能力。

總之，這是第一項(xiàng)為 CRC 患者確定和驗(yàn)證可靠、臨床上可行的 TFS 的研究，該研究對這些患者的臨床結(jié)果和免疫治療反應(yīng)具有獨(dú)立的預(yù)測價(jià)值。