2007（最后一題）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

A

原因：

1，大腸桿菌被污染長(zhǎng)了雜菌。

2，制作固體BL培養(yǎng)基的時(shí)候溫度還沒(méi)下降就加入了抗生素，導(dǎo)致抗生素失活。

3，未加抗生素或抗生素失活。

目的：

1，說(shuō)明了大腸桿菌是否有問(wèn)題。

2，說(shuō)明了抗生素是否有問(wèn)題。

B

原因：

1，抗生素使用錯(cuò)誤（抗生素用成了其他種類）。

2，抗生素濃度高。

3，涂板時(shí)玻璃棒太燙，或其他原因?qū)е麓竽c桿菌全部死亡。

4，沒(méi)轉(zhuǎn)進(jìn)去。

目的：

1，說(shuō)明大腸桿菌正常。

2，載體的抗性與其使用的抗生素是否相符。

C

對(duì)照三目的：檢查DNA連接酶是否有問(wèn)題。

對(duì)照四目的：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中載體自連的幾率，堿性磷酸酶可大大降低載體自連率。

2007生化簡(jiǎn)答

核酸的紫外吸收有何特點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)中如何用這一特點(diǎn)研究核酸？【三版上冊(cè)P507】

答：

（1）、核酸中的堿基具有共軛雙鍵，因而使其具有紫外吸收的性質(zhì)，最大吸收峰在260nm附近，不同的核苷酸有不同的吸收特性。

（2）、利用核酸的此種性質(zhì)可以用紫外分光光度計(jì)加以定性和定量測(cè)定。

①　根據(jù)260nm和280nm的吸光度的比值可以判斷核酸的純度。純DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8，純RNA的A260/A280應(yīng)達(dá)到2.0。樣品中如若含有雜蛋白及苯酚，A260/A280比值會(huì)明顯降低。

②　對(duì)于純的核酸樣品，可以根據(jù)260nm的吸光度（A）即可算出含量。通常以A值為1相當(dāng)于50μg/mL雙螺旋DNA或者40μg/mL單鏈DNA（或RNA），或者20μg/ml寡核苷酸計(jì)算。對(duì)于不純的樣品，可以用瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分出條帶后，經(jīng)過(guò)溴化乙錠染色在紫外燈下粗略估其含量。

③　測(cè)定核酸的摩爾磷吸光系數(shù)可以判斷DNA試劑是否變性或者降解。摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸，據(jù)此先測(cè)定核酸溶液中磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)ε（P）。核酸的ε（P）值較所含核苷酸單體的ε（P）要低。單鏈核苷酸的ε（P）值比雙螺旋結(jié)構(gòu)的要高，所以核酸發(fā)生變性時(shí)，ε（P）值升高，此現(xiàn)象為增色效應(yīng)。復(fù)性后ε（P）又降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。這是因?yàn)殡p螺旋結(jié)構(gòu)使得堿基的π電子云發(fā)生重疊，因而減少了對(duì)紫外光的吸收。

2008生化問(wèn)答第三題

假設(shè)一個(gè)細(xì)胞膜表面糖蛋白的一個(gè)三糖單位在介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞黏著中起著關(guān)鍵作用。設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)這一假設(shè)。

首先分析該三糖單位與蛋白質(zhì)氨基酸殘基的結(jié)合位點(diǎn)，然后采用定點(diǎn)突變技術(shù)置換該位點(diǎn)的氨基端殘基，使糖鏈不能結(jié)合上去。若此時(shí)，細(xì)胞之間不能黏著，則可證明該三糖單位在介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞黏著中起關(guān)鍵作用，若細(xì)胞仍黏著，則不起關(guān)鍵作用。

2008生化問(wèn)答第五題

設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案來(lái)驗(yàn)證你所研究的一個(gè)蛋白質(zhì)A在大腸桿菌中是否有表達(dá)。【三版上冊(cè)P278】

答：

方案一：免疫印記測(cè)定（western blot）

步驟：制備可能含有目的蛋白質(zhì)A的待檢樣品，對(duì)其進(jìn)行凝膠電泳分離，然后再將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜封閉，然后相繼用第一抗體、酶標(biāo)第二抗體以及底物（或者放射性同位素標(biāo)記的二抗）進(jìn)行處理。只有含有待測(cè)蛋白的條帶顯示顏色（或放射性自顯影法檢測(cè)），以此來(lái)判斷蛋白A是否表達(dá)。

方案二：ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）

原理：以待測(cè)定抗原（或者抗體）和酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，然后通過(guò)酶活力測(cè)定來(lái)確定抗原（或抗體）的含量。

步驟：1、制備可能含有目的蛋白質(zhì)A的待檢樣品，將其吸附到惰性表面（一般是96-井的聚苯乙烯塑料板）。2、加入非特異性蛋白質(zhì)一起溫育，封閉未被蛋白質(zhì)覆蓋的惰性表面，以防止隨后的步驟中的蛋白質(zhì)被吸附到表面。3、然后用抗蛋白A的抗體（第一抗體）處理。4、未被結(jié)合的抗體用緩沖液洗去，表面用抗第一抗體的抗體（第二抗體）處理，二抗與一個(gè)催化形成有色產(chǎn)物的酶共價(jià)連接。5、未被二抗結(jié)合的抗體洗去。6、最后加入與第二抗體偶聯(lián)的酶的底物，根據(jù)判斷有色產(chǎn)物形成有無(wú)來(lái)判斷蛋白A是否表達(dá)。

方案三：RNAi技術(shù)

根據(jù)蛋白質(zhì)A，設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA，轉(zhuǎn)化后看大腸桿菌是否存在相應(yīng)功能缺失。

（其他略有相關(guān)性的方案包括：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、免疫電鏡、免疫熒光等。）

2009生化問(wèn)答第九題

簡(jiǎn)述核酸分子雜交的基礎(chǔ)和應(yīng)用

應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA或RNA片段，按照堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子。

核酸分子雜交作為一項(xiàng)基本技術(shù)，已應(yīng)用于核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的各個(gè)方面。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度特異性，因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測(cè)和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用，而且在臨床上的診斷中的應(yīng)用也增多。目前已應(yīng)用于多種遺傳病的基因診斷，惡性腫瘤的基因分析，傳染病病原體的檢測(cè)等領(lǐng)域中。

2009生化問(wèn)答第十題

簡(jiǎn)述2-3種檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的方法。

蛋白芯片技術(shù)：將各種蛋白質(zhì)有序的固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測(cè)用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光染料的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的。

免疫共沉淀技術(shù)：用抗體將相應(yīng)特定蛋白沉淀的同時(shí)，與該蛋白特異性結(jié)合的其他蛋白也會(huì)被帶著一起沉淀出來(lái)的技術(shù)。

(1)免疫共沉淀(ColP)實(shí)驗(yàn)的原理與過(guò)程

免疫共沉淀(CoIP)實(shí)驗(yàn)的原理

免疫共沉淀(CoIP)技術(shù)的核心是通過(guò)抗體來(lái)特異性識(shí)別候選蛋白。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體(多抗或標(biāo)簽抗體)免疫沉淀X,在體內(nèi)與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能被沉淀下來(lái)。

2,免疫共沉淀(CoIP)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程

a，將靶蛋白的抗體通過(guò)親和反應(yīng)連接到固體基質(zhì)上

b.將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中

d.若靶蛋白與待篩選蛋白發(fā)生了相互作用，待篩選蛋白質(zhì)就通過(guò)靶蛋白與抗體和固體基質(zhì)相互作用而被分離。

酵母雙雜交系統(tǒng)

基本原理

a，把編碼已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)編碼區(qū)的表達(dá)載體上。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中使之表達(dá)帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白，與報(bào)告基因上游的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)相結(jié)合，準(zhǔn)備作為 誘餌 捕獲與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。

b.將已知的編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)的DNA分別與待篩選的cDNA文庫(kù)中不同插入片段相連接，獲得獵物載體，轉(zhuǎn)化含有 誘餌 的酵母細(xì)胞，一旦酵母細(xì)胞中表達(dá)的 誘餌 蛋白與 獵物 載體中表達(dá)的某個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AD和BD結(jié)構(gòu)域就會(huì)被牽引靠攏，激活報(bào)告基因表達(dá)。

c.分離有報(bào)告基因活性的酵母細(xì)胞，得到所需要的 獵物 載體，就能得到與已知蛋白相互作用的新基因。

應(yīng)用:

a，用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用

b，用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能

c.用于在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

d.用于疾病發(fā)生機(jī)制的研究和藥物的開(kāi)發(fā)

e，用于建立基因組蛋白連鎖圖

f，用于確定蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域或活性位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)Pull-down的實(shí)驗(yàn)原理

利用GST與谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST融合，將融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上。當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過(guò)層析柱時(shí)就可被吸附而分離，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選出相應(yīng)的目的蛋白。

(2)蛋白質(zhì)Pull-down的主要步驟

1,GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育，包括a，單一明確的重組蛋白b，細(xì)胞裂解蛋白混合液c，體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白。

2,混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠在4℃反應(yīng)2h，離心得沉淀。

3,沉淀加入Loadng Buffer煮沸3min，高速離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

4,考馬斯亮藍(lán)對(duì)SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，觀察特異沉降的蛋白帶，接著進(jìn)行質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白;或?qū)﹄娪竞蟮哪z做western Blot來(lái)確定沉降的蛋白中是否含有目的蛋白。

2010最后一題

研究蛋白質(zhì)與染色質(zhì)DNA相互作用方法主要有哪些？簡(jiǎn)述其中一種的原理和流程

(1)研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的方法

凝膠阻滯(EMSA)實(shí)驗(yàn)、DNase I足跡法、酵母單雜交技術(shù)、染色質(zhì)免疫共沉淀(Chip)技術(shù)、甲基化干擾試驗(yàn)和體內(nèi)足跡試驗(yàn)等。

(2)酵母單雜交系統(tǒng)

酵母單雜交系統(tǒng)是用于研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法，可通過(guò)篩選DNA文庫(kù)直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。

1.原理

真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA特異性結(jié)合功能域和一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子(Pmin)的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游，然后將編碼待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。

2.步驟

a. 構(gòu)建報(bào)道子載體。將已知的特定順式作用元件按同一方向隨機(jī)串聯(lián)到一個(gè)最基本啟動(dòng)子(Pmin)的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。

b. 篩選含有報(bào)道子載體的酵母細(xì)胞。將構(gòu)建好的報(bào)道子載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并篩選合適的3-AT濃度。

c. 構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫(kù)。將樣品經(jīng)過(guò)一定處理之后，提取mRNA,經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.

d. 篩選cDNA融合的表達(dá)文庫(kù)。將報(bào)道子、cDNA和融合表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化到酵母中，在相應(yīng)的SD培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。

e. 對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，去除假陽(yáng)性克隆。

f，對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2010簡(jiǎn)答第三題

獲得一個(gè)新基因，如何研究該基因的功能。

1，分析該基因的序列，根據(jù)其mRNA序列，找出其CDS區(qū)。

2，根據(jù)其CDS區(qū)序列，設(shè)計(jì)siRNA序列，由公司合成（同時(shí)合成NC，即無(wú)關(guān)序列）

3，將siRNA和NC分別轉(zhuǎn)入該基因所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中，36小時(shí)后提取總RNA，及蛋白（蛋白裂解液中加入一定量的蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑，PMSF）

4，吸取一部分的RNA,反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。根據(jù)該基因CDS區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，對(duì)其基因進(jìn)行定量分析，確定其siRNA干擾效果。

5，將剩余的RNA和總蛋白質(zhì)送至公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和蛋白質(zhì)組測(cè)序，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平比較siRNA組和NC組存在的差異。推導(dǎo)出該基因?qū)δ男┫掠瓮酚杏绊憽?/p>

6，轉(zhuǎn)染，36小時(shí)后測(cè)流式（凋亡，周期，增殖）判斷其對(duì)細(xì)胞有怎樣的影響，從而推導(dǎo)出對(duì)組織的影響。（若是癌細(xì)胞，則重點(diǎn)看其對(duì)周期的影響。）

7，驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

8，做相關(guān)功能蛋白的western blot。比如奶牛的乳腺上皮細(xì)胞主要功能是泌乳，則需檢測(cè)乳蛋白，酪蛋白的表達(dá)量?？捎妹嘎?lián)免疫吸附法檢測(cè)處理36小時(shí)后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。

2011年簡(jiǎn)答題第五題

某研究生將一基因?qū)胫参锛?xì)胞A檢測(cè)該基因整合到植物基因組。B。檢測(cè)該基因表達(dá)mRNA。C.檢測(cè)該基因表達(dá)蛋白質(zhì)。分別用什么方法檢測(cè)。

A熒光原位雜交：首先對(duì)寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過(guò)和熒光素分子相偶聯(lián)的單克隆抗體來(lái)確定該DNA序列在染色體的位置。

B.原位雜交：提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)該基因的CDS區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物。以未導(dǎo)入該基因的樣本為對(duì)照組，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，用??t方法分析結(jié)果，若存在顯著性差異，則認(rèn)為該mRNA有表達(dá)。

C.以為未導(dǎo)入該基因的植物為對(duì)照，提取蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，100℃加熱五分鐘，充分變性，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。最后進(jìn)行蛋白灰度分析，若實(shí)驗(yàn)組（導(dǎo)入該基因）和對(duì)照組（未導(dǎo)入該基因）存在顯著性差異，則認(rèn)為該基因蛋白已表達(dá)。

2011問(wèn)答題第4題

請(qǐng)?jiān)囀鯯DS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理。

被測(cè)蛋白只能與標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，而這種結(jié)合不改變?cè)摰鞍自谀z電泳中的相對(duì)分子質(zhì)量。經(jīng)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，封閉固相載體未反應(yīng)的位點(diǎn)。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影檢測(cè)被測(cè)蛋白。

2012年問(wèn)答題第一題（同2011年，四，1）

DNA分子克隆：將DNA的限制酶切片段插入克隆載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)無(wú)性繁殖，以獲得相同的DNA擴(kuò)增分子。

重組DNA的基本步驟：

1，培養(yǎng)細(xì)胞，確定該細(xì)胞中該基因的確表達(dá)

2，提取RNA，提取過(guò)程防止污染

3，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA

4，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物兩端應(yīng)該加上不同的酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基。）

5，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收

6，酶切：對(duì)純化回收后的產(chǎn)物和載體（即質(zhì)粒）進(jìn)行酶切

7，純化再回收

8，連接：加入適量的buffer和T4連接酶，酶切后的目的片段和載體，在酶的最適溫度下進(jìn)行連接（目的片段與載體的質(zhì)量比3~5：1最為合適）

9，用冷熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，加入1ml的不含抗生素的液體lb培養(yǎng)基，在37°C的條件下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。

10，將渾濁的菌液涂抹在含有相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基表面，先正置15min，然后倒置于37°C培養(yǎng)箱過(guò)夜

11，挑菌：將固體LB表面長(zhǎng)出的菌粒挑起，放到含有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖晃6~10小時(shí)，確保菌液變濁，進(jìn)行菌液測(cè)序，保證菌液含有重組載體。提取質(zhì)粒，此時(shí)質(zhì)粒為重組DNA。該重組載體于-20°C保存。

2013簡(jiǎn)答題第四題

試述免疫共沉淀的概念，原理和優(yōu)缺點(diǎn)。

免疫共沉淀(ColP)實(shí)驗(yàn)的概念

用抗體將相應(yīng)特定蛋白沉淀的同時(shí)，與該蛋白特異性結(jié)合的其他蛋白也會(huì)被帶著一起沉淀出來(lái)的技術(shù)。

免疫共沉淀(CoIP)實(shí)驗(yàn)的原理

免疫共沉淀(CoIP)技術(shù)的核心是通過(guò)抗體來(lái)特異性識(shí)別候選蛋白。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體(多抗或標(biāo)簽抗體)免疫沉淀X,在體內(nèi)與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能被沉淀下來(lái)。

免疫共沉淀(CoIP)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)

?a，參與相互作用的蛋白處于天然狀態(tài)

?b，蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，避免了人為的影響，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到 的蛋白可信度高

?c.分離得到的蛋白復(fù)合物是天然狀態(tài)的

?d，在體內(nèi)捕獲轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的相互作用，快速提供一種或多種基因的調(diào)控機(jī)制。

缺點(diǎn)

?a，靈敏度不高，檢測(cè)不到低親和力和瞬時(shí)的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用

?b，相互作用的蛋白質(zhì)需要第三者作為中間橋梁

?c.方法存在冒險(xiǎn)性，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白，以選擇檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果

?d，需要特殊修飾標(biāo)簽的高度特異性抗體。