小云：師兄救我啊！??！我用一年時間收集的樣本，然后花費了導(dǎo)師一大筆科研經(jīng)費，做的高通量測序結(jié)果終于拿到了?？墒沁@幾千個差異表達(dá)基因，實在眼花繚亂，該怎么選擇基因去驗證了？

胖師兄：哈哈，這個問題我也曾遇到過，我愿稱之為“幸福的煩惱”。手頭沒有待研究的靶基因，測序是最優(yōu)解。但是測序之后，如何挑選基因又稱為難題了。實際上，不止RNA-seq，包括外顯子測序、各種非編碼RNA測序（miRNA、lncRNA、circRNA和piRNA等）和蛋白組測序等等，都會面對基因篩選的問題，而高通量測序基因篩選的原則都是相通的。

小云：有篩選原則呀，那就是說有的解了，哈哈哈，師兄果然是最胖（棒）的，快快教教我呀，剛好也能給粉絲們參考下。

胖師兄：哈哈哈，被小迷妹夸，自尊心再次得到滿足，那我就從宏觀到微觀，一條條來說。第一條，多組學(xué)測序整合出來的數(shù)據(jù)質(zhì)量，一般總是優(yōu)于單組學(xué)測序結(jié)果的。比如轉(zhuǎn)錄組+蛋白組+代謝組，這三種測序手段基本上是一種逐級驗證的關(guān)系，把這3個測序數(shù)據(jù)取一個交集，那能很大程度縮小我們的范圍，提高準(zhǔn)確率。

小云：嗯，這個我也聽說過，可以說多組學(xué)整合測序除了更花錢這一個缺點之外，其它所有的都是優(yōu)點，那第二條原則了？

胖師兄：第二條就重要了，要從面匯聚到一條線，也就是說在機制層面，咱總得有個具體的關(guān)注點。比如我們前面分享過很多當(dāng)前熱點方向，像鐵死亡、腫瘤免疫微環(huán)境、線粒體代謝、RNA甲基化等調(diào)控通路。這些方向可以是測序前我們就選好了，然后在數(shù)據(jù)分析時，有意識的往這些方向靠；或者根據(jù)測序出的數(shù)據(jù)具體去尋找調(diào)節(jié)通路，也就是我們通常見到的GO/KEGG分析（圖1）了。

圖1 GO分析示意圖

小云：哦，原來還有兩種方式可以選了，那感覺第二種更客觀一些，是吧？畢竟結(jié)果出來是啥就是啥，我們提前去預(yù)判通路，總會出現(xiàn)不匹配的情況吧？

胖師兄：嗯，你想的挺對的。實際上，第三條，對于直接測序來說，我們會推薦根據(jù)測序結(jié)果去挑選富集通路；但如果因為經(jīng)費或者樣本問題，無法做測序，那用公共數(shù)據(jù)挖掘，我們倒是推薦先預(yù)設(shè)分子機制，通過分析來驗證的。

小云：哈哈，主要是師兄你講的好，我能聽明白。對了，我有個疑問，如果我打算選擇20個基因來驗證，我是挑選10個通路，每個通路選兩個基因，還是挑選2個通路，每個通路選10個基因了？

胖師兄：我理解你的意思，不要把雞蛋放到一個籃子里，想多選幾個通路，分擔(dān)風(fēng)險。不過必要性不大，因為一般我們篩選的差異通路都是TOP10之內(nèi)的，驗證成功率一般也比較高的，與其廣撒網(wǎng)，但都沒說清楚，不如第四條，優(yōu)先深入探討1-2個通路即可，不要貪多求全。

小云：嗯，了解，那對于同一個通路里，那么多基因，我又該如何篩選了？

胖師兄：這個時候就該第五條，參考PPI或者其它網(wǎng)絡(luò)（cytohubba及MCODE插件等），篩選關(guān)鍵節(jié)點基因（圖2）。

圖2 MCODE插件尋找網(wǎng)絡(luò)hub基因

小云：師兄果然是師兄，太厲害了。那從基因?qū)用嬖摽紤]哪些參數(shù)了？

胖師兄：這個就相對簡單了，第六條，我們可以關(guān)注差異倍數(shù)高（log2（FC）絕對值高，一般是大于1或者2，圖3）+顯著性高（校正P值＜0.05）+基因表達(dá)絕對豐度高(至少在一個樣品中的表達(dá)量RPKM/FPKM大于50)

圖3 基因差異表達(dá)倍數(shù)統(tǒng)計（log2（FC）

小云：嗯，那具體在驗證基因數(shù)量以及如何分配驗證基因，還有什么建議嗎？

胖師兄：第七條，驗證基因數(shù)量一般不低于10個，有條件的可以加到20個。畢竟還會存在成功率的問題，最終得保持8個左右驗證成功的基因。至于基因的類型，我的看法如下，第八條，驗證的基因不能全部是研究太多的（已成定論，創(chuàng)新性不足），也不能全部沒有研究過（容易是陰性結(jié)果）。具體比如說驗證10個基因，有3個是研究有定論的（確保有陽性結(jié)果）+5個其他疾病中有研究的（50%陽性結(jié)果）+2個沒有研究過的（提高創(chuàng)新性）

小云：真是一場高湯滿滿的學(xué)習(xí)盛宴，師兄你太好了，把我所有的疑惑都解開了。走走走，去哪吃飯你隨便挑？

胖師兄：師兄我這幾年摸爬滾打的經(jīng)驗都無私分享出來了，這頓飯我該去心安理得的吃，哈哈。等你把驗證實驗都做完，我覺得還有一頓飯也跑不掉，你估計還會來問我，驗證實驗結(jié)果不理想該怎么辦？這些都是我之前趟過的雷，你肯定也避免不了。

小云：好好好，那下次我們就再聊聊“驗證實驗結(jié)果不理想”的問題，感興趣的小伙伴記得關(guān)注我們哦。

小云有話說

測序后的驗證基因篩選，是一個綜合性問題，甚至在課題設(shè)計時就開始要構(gòu)思的， 同時對研究者對該領(lǐng)域的了解深度是一個大考驗。高級生信分析以及定制化數(shù)據(jù)分析，則是我們提供給大家的尚方寶劍。通過最大限度的整合公共數(shù)據(jù)整合分析、提供多種數(shù)據(jù)分析思路，在深度挖掘數(shù)據(jù)資源的同時，降低假陽性，從數(shù)千個差異基因中定位出幾十個最具有價值的基因，極大助力我們的研究。我們可以提供如下技術(shù)：免費數(shù)據(jù)評估技術(shù)、高級生信分析以及定制化數(shù)據(jù)分析等。有需要的讀者，快來咨詢小云吧！