小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1被廣泛用作人乳腺癌的同源腫瘤模型，而人乳腺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的腫瘤實(shí)體。4T1細(xì)胞很容易移植到乳腺中，它們免疫原性差，致瘤性高，侵襲性強(qiáng)，且可以自發(fā)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。因此，原發(fā)腫瘤的位置及其轉(zhuǎn)移擴(kuò)散與患者的臨床病程非常相似。此外，4T1細(xì)胞常用于研究雌激素受體（ER），孕激素受體（PgR）和表皮生長(zhǎng)因子受體2（ErbB2）蛋白表達(dá)缺陷的三陰性乳腺癌（TNBC）。據(jù)估計(jì)，這種三陰性表型在每年確診的乳腺癌患者中占比超過(guò)17%。早期的研究報(bào)道稱，接種EMT6疫苗的小鼠顯然比接種4T1疫苗的小鼠表現(xiàn)出更高的保護(hù)免疫力?；旌弦呙缃臃N研究顯示，4T1疫苗接種引起局部和全身免疫損傷，因此在評(píng)估新的治療方法時(shí)，4T1是最受歡迎的同源腫瘤模型之一。

乳腺癌是美國(guó)女性的第二大常見死因。大多數(shù)乳腺癌死亡是由于乳腺癌從原發(fā)部位復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移到身體其他部位。乳腺癌通常轉(zhuǎn)移到肺，肝，腦，淋巴結(jié)和骨骼。由于一個(gè)模型不能適用于所有的研究，根據(jù)研究性質(zhì)，不同類型的小鼠模型會(huì)被用來(lái)模擬乳腺癌的自然過(guò)程。這些模型包括組織或細(xì)胞接種、異位移植、異種移植、皮下移植、原位移植和心臟內(nèi)移植

研究人員選擇4T1細(xì)胞系是因?yàn)槠渚哂械膸讉€(gè)特點(diǎn)能使其適用于細(xì)胞模型以及人類癌癥動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)。與其他癌細(xì)胞系相比，它的優(yōu)點(diǎn)是與人乳腺癌中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移非常相似。迄今為止，大多數(shù)基因組編輯研究旨在通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物模型更好地了解疾病，而科學(xué)家們則努力衡量這些方法用于人類的安全性和有效性?；蚪M編輯和生物標(biāo)志物測(cè)試開啟了患者量身定制療法的大門，這些療法將帶來(lái)不一樣的結(jié)果并挽救生命。這是乳腺癌治療的未來(lái)。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)為乳腺癌基因/細(xì)胞治療領(lǐng)域帶來(lái)了寶貴的機(jī)會(huì)，可能在乳腺癌治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

應(yīng)用

1.?多組學(xué)研究：基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組學(xué)。

2.?癌癥復(fù)發(fā)：確定癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)基因，相互作用網(wǎng)絡(luò)，下游研究和腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防措施。

3.?基因發(fā)現(xiàn)：識(shí)別新的癌癥驅(qū)動(dòng)基因，發(fā)現(xiàn)癌癥特異性弱點(diǎn)。

4.?癌癥疫苗：自體腫瘤細(xì)胞疫苗（ATCV），腫瘤來(lái)源細(xì)胞因子，ATCV免疫原性，免疫抑制細(xì)胞因子，基于癌細(xì)胞的疫苗等。用于治療用癌癥疫苗或預(yù)防性癌癥疫苗的基因編輯腫瘤細(xì)胞的研究。

5.?藥物發(fā)現(xiàn)：新的治療弱點(diǎn)和更有效治療的發(fā)展

6.?疾病建模：同種異體移植和異種移植疾病建模，疾病進(jìn)展和機(jī)制研究。

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CRISPR/Cas9基因編輯4T1細(xì)胞

基因組編輯是精確修飾基因內(nèi)的核苷酸序列以加入或刪除特定DNA片段的過(guò)程。CRISPR/Cas9可以糾正基因組中的錯(cuò)誤，并且快速，廉價(jià)且相對(duì)容易地啟動(dòng)或終止細(xì)胞和生物體中的某些基因。4T1細(xì)胞是小鼠癌細(xì)胞系模型，廣泛用作人乳腺癌研究的同基因腫瘤模型（耐藥基因，化療耐藥基因，藥物發(fā)現(xiàn)，疾病機(jī)制、發(fā)病、發(fā)展和治療）?；蚓庉嬁梢栽诩?xì)胞中產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)基因敲除，校正突變或插入報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因。這些基因編輯4T1細(xì)胞系可以幫助研究人員研究乳腺癌標(biāo)志，藥物抗性機(jī)制揭示，以及癌癥治療，細(xì)胞死亡研究，功能基因組學(xué)，信號(hào)通路，藥物發(fā)現(xiàn)，藥物反應(yīng)和細(xì)胞治療。CRISPR/Cas9技術(shù)積極推動(dòng)乳腺癌體內(nèi)和體外基因編輯的進(jìn)步，解決乳腺癌轉(zhuǎn)移，耐藥，化療耐藥的復(fù)雜性，對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生巨大影響。

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案例分析：CRISPR/Cas9介導(dǎo)的乳腺癌研究顯示內(nèi)源性PAD4通過(guò)細(xì)胞外染色質(zhì)形成促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移

在美國(guó)，乳腺癌是最常見的癌癥之一，也是美國(guó)女性中癌癥死亡的第二大原因。隨著原發(fā)腫瘤的侵襲性增長(zhǎng)，乳腺癌死亡的主要原因是乳腺癌轉(zhuǎn)移到身體其他部位。由于異質(zhì)性和缺乏明確的分子靶點(diǎn)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的5年生存率比較低，尋找限制轉(zhuǎn)移的方法仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。病理研究發(fā)現(xiàn)，PAD4在結(jié)腸、十二指腸、食管、輸卵管、膽囊、肺、卵巢、腮腺、胰腺、前列腺、直腸、小腸、胃、甲狀腺、子宮等多種腫瘤組織中均有顯著表達(dá)。肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4/PADI4）是一種翻譯后修飾酶，可以將蛋白質(zhì)精氨酸或單甲基精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。

為了確定PAD4表達(dá)是否與人類乳腺癌相關(guān)，研究人員查找了TCGA癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)和Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)。在對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行meta分析后，他們發(fā)現(xiàn)與正常組相比，PAD4的表達(dá)量的升高與乳腺癌顯著相關(guān)（圖1A）。為了研究PAD4在乳腺癌中的功能作用，他們發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性乳腺癌4T1細(xì)胞中PAD4的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他癌細(xì)胞系（圖1B）。他們量化了4T1細(xì)胞中PADI4的量，發(fā)現(xiàn)5 × 104?細(xì)胞中的PADI4蛋白與100ng的純化PAD4蛋白大致相當(dāng)，相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞約有1600萬(wàn)個(gè)PAD4蛋白（圖1C）。

PAD4是一種鈣依賴性酶。因此，他們?cè)阝}離子載體處理后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡?Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鈣離子載體處理后用H3Cit抗體（針對(duì)含有Cit2，Cit8和Cit17的組蛋白H3?N-末端肽制備）檢測(cè)到的組蛋白H3瓜氨酸化顯著增加（圖2A）。為了測(cè)試組蛋白瓜氨酸化是如何影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的，他們通過(guò)免疫染色分析了細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)高度解稠密區(qū)H3Cit染色顯著增加（圖2B）。他們分別用α-H3Cit26（圖2C和2D）和α-H4Cit3抗體（圖2E和2F）測(cè)試了兩個(gè)位置的瓜氨酸化水平。為了進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞外染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的存在，將鈣離子載體處理過(guò)和未處理的完整4T1細(xì)胞用MNase消化，MNase是一種切割染色質(zhì)中核小體之間的核酸酶（圖2G）。因此，組蛋白H3蛋白只能在鈣離子載體處理過(guò)的4T1細(xì)胞的上清液中檢測(cè)到（圖2H）。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)在4T1細(xì)胞暴露于HMGB1后，細(xì)胞外DNA和H3Cit染色輕度增加，表明HMGB1能夠誘導(dǎo)4T1細(xì)胞的CECN(圖2I和2J)。

研究人員發(fā)現(xiàn)抑制PAD降低了高瓜氨酸化的發(fā)生率和CECN的釋放(圖3A)（圖3A）。他們使用CRISPR/Cas9方法敲除了腫瘤細(xì)胞中的Padi4，并選擇了兩個(gè)單細(xì)胞克隆，分別命名為Padi4 CRISPR-Ex1-1-C11和Padi4 CRISPR-Ex2-6-E2，其中Padi4缺失發(fā)生在1號(hào)和2號(hào)外顯子上。通過(guò)Sanger測(cè)序和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Padi4的缺失（圖3B和3C）。鈣離子載體刺激后未檢測(cè)到瓜氨酸化和CECN的形成（圖3D）。結(jié)果表明，組蛋白高瓜氨酸化和CECN形成依賴于PAD4活性。

為了研究4T1細(xì)胞是否可以在體內(nèi)釋放CECN，他們比較了原位移植且大小匹配的4T1野生型和Padi4敲除腫瘤的瓜氨酸化水平，僅在親代細(xì)胞系和親代腫瘤中檢測(cè)到PAD4（圖4A）。為了測(cè)試高瓜氨酸化是否導(dǎo)致染色質(zhì)解濃縮（如圖4B所示），研究人員通過(guò)免疫染色檢測(cè)潛在的CECN結(jié)構(gòu)（圖4C）。BALB/c Padi4敲除小鼠移植腫瘤的H&E染色和免疫染色實(shí)驗(yàn)如圖4 - 4F所示。原發(fā)腫瘤中的H3Cit染色是基于區(qū)域的并且具有不同的染色模式，其中一些區(qū)域?yàn)镠3Cit染色陽(yáng)性而另一些區(qū)域?yàn)殛幮裕▓D4G）。這可能是由于腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性導(dǎo)致，存在不同水平的ROS或死亡細(xì)胞數(shù)量。

為了評(píng)估PAD4在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞自主作用，研究人員將4T1野生型和Padi4敲除細(xì)胞分別移植到野生型雌性BALB/c小鼠的乳腺中。盡管所有4T1細(xì)胞類型顯示出相似程度的體外生長(zhǎng)速率（圖5A），但在野生型BALB/c小鼠中，同種異體移植Padi4敲除腫瘤的生長(zhǎng)明顯比野生型4T1腫瘤更慢（圖5B）。在Padi4敲除的BALB/c小鼠中也觀察到Padi4敲除腫瘤的生長(zhǎng)速率降低（圖5C）。類似地，腫瘤內(nèi)PAD4抑制劑治療也降低了原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)速率（圖5D）。

與來(lái)自相同小鼠腫瘤但不能轉(zhuǎn)移的同胞細(xì)胞系67NR相比，4T1細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)移能力。如圖6A所示，與67NR細(xì)胞相比，4T1細(xì)胞中的PAD4表達(dá)水平明顯更高。同種異體移植后，攜帶野生型腫瘤的小鼠在肺表面形成的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著高于兩種Padi4敲除細(xì)胞系（圖6B和6C）。在攜帶Padi4?CRISPR基因編輯癌細(xì)胞的小鼠腫瘤中，即使在長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)后，肺轉(zhuǎn)移仍顯著減少(圖6D-6F)。長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)之后，攜帶源自Padi4敲除癌細(xì)胞的腫瘤的小鼠的肺轉(zhuǎn)移仍顯著降低（圖6D-6F）。為了檢驗(yàn)PADI4抑制在群體水平上的影響，研究人員還使用PADI4基因敲除小鼠在YW4-03腫瘤內(nèi)治療模型中比較了肺轉(zhuǎn)移（圖6G和6H）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CECNs參與轉(zhuǎn)移的想法，他們使用DNase I破壞細(xì)胞外DNA，包括在Padi4敲除小鼠中生長(zhǎng)的4T1野生型腫瘤中的CECN結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移顯著減少（圖7A和7B）。此外，通過(guò)用集落形成測(cè)定分析血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），測(cè)試在癌細(xì)胞中表達(dá)的PAD4是否影響血管內(nèi)滲透。Padi4缺失和DNase I處理都不影響大小匹配的荷瘤小鼠的CTC數(shù)量，表明癌細(xì)胞內(nèi)源性PAD4不通過(guò)內(nèi)滲過(guò)程來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)移（圖7C-7F）。為了進(jìn)一步測(cè)試PADI4是否在血管內(nèi)滲透后的步驟中起作用，他們通過(guò)將相同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞通過(guò)靜脈注射到小鼠中來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移測(cè)定。與Padi4野生型細(xì)胞相比，4T1細(xì)胞中Padi4的缺失并未顯著減少累積的癌細(xì)胞數(shù)量（圖7G和7H）。

綜上所述，研究人員在體外和體內(nèi)確定了4T1細(xì)胞中PADI4介導(dǎo)的CECN的發(fā)生。腫瘤微環(huán)境含有激活PADI4的信號(hào)，并且在4T1細(xì)胞中敲除PADI4或去除細(xì)胞外DNA(包括用DNase I去除CECN),?可以抑制轉(zhuǎn)移性肺定植。PAD4在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的重要作用使其成為切實(shí)的治療手段。

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源井生物作為一家專注于細(xì)胞基因編輯的企業(yè)，目前已利用獨(dú)家CRISPR技術(shù)——CRISPR-UTM對(duì)4T1細(xì)胞進(jìn)行了基因編輯，構(gòu)建了多種4T1細(xì)胞現(xiàn)貨：基因敲除4T1細(xì)胞、4T1-Cas9細(xì)胞系、4T1-Luc細(xì)胞系、4T1-mCherry-EGFP等（見下表），可為乳腺癌研究提供豐沛的資源和服務(wù)，快至1周交付。還有近3000種KO細(xì)胞現(xiàn)貨在庫(kù)，覆蓋8大信號(hào)通路和40種疾病，可以復(fù)制鏈接入庫(kù)了解>>https://www.ubigene.com/ez_editor/?cate=16

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