這種RNA電泳圖（圖1-4）您眼熟么？是您曾經(jīng)的作品么？為什么跑個(gè)電泳會(huì)跑成這樣？雖然說(shuō)前面3張圖能夠看出RNA的質(zhì)量，但是這種圖確實(shí)算不上美觀，第四張圖就更不用說(shuō)了。那么怎么樣才能跑出高顏值的RNA瓊脂糖電泳圖呢？

圖1-4 | 各種RNA瓊脂糖電泳質(zhì)檢圖

梳子的選擇

跑過(guò)電泳的人都知道，制膠時(shí)要根據(jù)需求選擇合適的梳子。在跑RNA時(shí)，為了讓電泳條帶清晰整齊，我們通常選擇細(xì)長(zhǎng)的梳子如下圖（圖5）所示：中間的紅色梳子齒寬而細(xì)，用這種梳子制出來(lái)的膠的膠孔同樣細(xì)長(zhǎng)，即使在電泳過(guò)程中RNA有些彌散，也不至于讓條帶粗胖粗胖的，影響美觀。

圖5 | 不同規(guī)格的梳子

制膠

制膠是電泳檢測(cè)中關(guān)鍵的一步。配制的膠表面要光滑平整。以1%的瓊脂糖膠為例：準(zhǔn)確稱取0.5g 瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入50ml 1×TAE釋緩沖液，放入微波爐里中加熱，直至沸騰，取出錐形瓶稍微晃動(dòng)混勻后再放入微波爐繼續(xù)加熱，后續(xù)每15秒拿出輕輕晃動(dòng)一下，大概三次左右，直到溶液中的瓊脂糖完全溶解，判斷標(biāo)準(zhǔn)是溶液中不再出現(xiàn)發(fā)亮的小顆粒即可，溶液均勻澄清。將完全溶解的瓊脂糖溶液置于室溫冷卻至50-60℃。也可通過(guò)自來(lái)水沖錐形瓶瓶壁進(jìn)行快速冷卻，冷卻過(guò)程中要隨時(shí)檢測(cè)溶液溫度，如果溫度過(guò)低了會(huì)導(dǎo)致膠凝固在瓶壁上，影響后續(xù)制膠效果。

用移液器往冷卻至50-60℃瓊脂糖溶液中加入0.5ul的EB（也可以選擇其他核酸染料，具體步驟需按照具體染料要求操作），搖勻后緩慢的倒進(jìn)組裝好的膠托內(nèi)。注意液體傾倒速度不宜過(guò)快，否則會(huì)在膠的表面形成一個(gè)陡坡，導(dǎo)致膠的厚度不均勻。此處敲黑板：EB有毒，一定要戴一次性手套進(jìn)行防護(hù)。

圖6-9 | 制膠所需物料

樣本的準(zhǔn)備

在準(zhǔn)備RNA質(zhì)檢前，需要先對(duì)RNA進(jìn)行濃度測(cè)定，一般情況下，同批抽提的多管RNA濃度會(huì)有差異，為了讓電泳條帶均勻整齊，需要先對(duì)RNA樣本進(jìn)行濃度調(diào)整。在所有樣本濃度差異不大的情況下，要考慮的是樣本濃度是否過(guò)高或過(guò)低；在一批樣本濃度相差較大時(shí)需要對(duì)濃度進(jìn)行調(diào)整。經(jīng)過(guò)多次摸索我們發(fā)現(xiàn)RNA濃度在150ng/μl，上樣總量500ng左右時(shí)跑出來(lái)的RNA的條帶比較漂亮。如果超過(guò)這個(gè)濃度可以加水稀釋。上樣的體積要根據(jù)膠孔的大小進(jìn)行調(diào)整，通常我們用小膠孔梳子RNA整體的體積以不超過(guò)7ul為好，因?yàn)槟z孔的大小是有限度的，太多了會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)不進(jìn)去哦。樣本和上樣緩沖液可以在一次性手套上先混勻（圖10）。

圖10?

點(diǎn)樣

點(diǎn)樣動(dòng)作要迅速，做到心中有數(shù)，手上不抖。如果手比較穩(wěn)，可以選擇單手持移液器（圖11），但是這種方法適用于“老手”，一般新手或不經(jīng)常做電泳的同學(xué)最好是兩只手配合。右手持移液器，左手拖住移液器另一面（圖12），維持移液器的穩(wěn)定，防止手抖導(dǎo)致扎破膠孔。另外就是點(diǎn)樣的動(dòng)作要迅速，防止RNA在室溫暴露實(shí)踐過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高導(dǎo)致樣本降解。確保實(shí)驗(yàn)所使用的水和上樣緩沖液無(wú)RNase，點(diǎn)樣用的移液器頭也需要經(jīng)過(guò)滅菌。

不要戳膠，如果你把膠孔戳穿了，那RNA會(huì)從漏了的小洞跑出去哦，這樣跑出來(lái)的條帶可能就會(huì)沒(méi)有那么完美了。

最后，注意上樣順序，注意上樣順序，注意上樣順序，一個(gè)樣本錯(cuò)誤就會(huì)導(dǎo)致你對(duì)于整個(gè)檢測(cè)結(jié)果判斷不準(zhǔn)確。

圖11-12

電泳

對(duì)于RNA 的檢測(cè)，我們一般以120v，15分鐘為準(zhǔn)，電泳結(jié)束之后指示劑的位置如下圖（圖13）所示。切記計(jì)時(shí)，電泳結(jié)束后立即將膠從電泳槽中取出觀察。不要電泳過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，條帶會(huì)變得彌散，觀察效果會(huì)大打折扣。

圖13

拍膠

這是最后一步了，使用凝膠成像儀（圖14）對(duì)瓊脂糖膠進(jìn)行觀察。選擇紫外光源，調(diào)節(jié)曝光，焦距至最佳狀態(tài)進(jìn)行觀察并拍照保存。為了拍到清晰美觀的照片，可以在不同焦距下多拍幾張，最后保存效果最好的照片，而且通過(guò)這種比較練習(xí)，相信新手做幾次也能拍出高顏值的瓊脂糖膠。

圖14?| 凝膠成像儀

結(jié)果判定

不同物種的RNA條帶差異還是挺大的。展示一下我們過(guò)往處理過(guò)的樣本的RNA（圖15-26）：

1，

2、

3、

圖15-26

RNA檢測(cè)技巧，你get到了嗎？

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