為了確保干擾序列的有效性，大家會(huì)優(yōu)先從文獻(xiàn)中查找已驗(yàn)證過(guò)的siRNA，但研究的基因千千萬(wàn)，不是每個(gè)基因都恰好有經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的干擾序列，遇到這種情況，免不了需要自己設(shè)計(jì)siRNA。今天小編就和大家講講siRNA設(shè)計(jì)原則和方法，希望能幫到正在研究基因干擾的小伙伴~

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siRNA設(shè)計(jì)原則

（1）siRNA序列在靶基因中的位置

一般從靶基因起始密碼子AUG下游50~100個(gè)核苷酸開(kāi)始搜尋理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。

（2）siRNA序列的起始?jí)A基與長(zhǎng)度

siRNA序列最好為AA（N n）UU（N 代表任意堿基，n為堿基數(shù)目）， NA（N n）?UU和NA（N n）NN序列也可以。19-29個(gè)核苷酸的siRNA序列通常是最有效的，長(zhǎng)于30個(gè)核苷酸可導(dǎo)致非特異性沉默。

（3）siRNA 3’端突出堿基的選擇

通常情況下，siRNA與3’端為dUdU或者dTdT的游離堿基的mRNA結(jié)合效率更高。建議用dTdT取代3′端的2 個(gè)堿基突出，增強(qiáng)siRNA 雙鏈復(fù)合體的穩(wěn)定性。

（4）siRNA序列中的G/C含量

G/C含量在35%~55%的siRNA序列，其沉默基因效果較好。

（5）siRNA 中應(yīng)避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列

連續(xù)2個(gè)以上的G和C可能會(huì)降低雙鏈RNA 的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制RNAi作用；連續(xù)3個(gè)以上的U和A可能終止由RNA Polymerase III介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。siRNA序列中的重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)可能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在會(huì)降低siRNA的有效濃度和沉默效率。

（6）siRNA雙鏈的內(nèi)在穩(wěn)定性

siRNA正義鏈的5’端第一個(gè)堿基盡量為G或C；反義鏈5’端的第一個(gè)堿基盡量為A或U。

（7）siRNA正義鏈的堿基偏愛(ài)性

正義鏈的第一位和第十九位堿基為A；正義鏈的第十位堿基為U；正義鏈的第十三位堿基不為G；正義鏈的第十九位堿基不為G或C時(shí)，siRNA 序列具有較高的基因沉默效率。

（8）siRNA 序列的特異性

目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)siRNA的干擾效率與mRNA中具體位置的關(guān)系，為確保對(duì)靶mRNA的有效抑制，針對(duì)每一個(gè)靶基因結(jié)合上述siRNA設(shè)計(jì)原則選擇靶點(diǎn)相差25bp以上的4星半以上的至少3條序列。

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siRNA設(shè)計(jì)常用程序

以上是常用的三個(gè)siRNA在線設(shè)計(jì)程序，小伙伴可直接將下方網(wǎng)址復(fù)制到瀏覽器中查看哦

http://sidirect2.rnai.jp/

https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/

https://www.invivogen.com/sirnawizard/

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siRNA設(shè)計(jì)步驟

以人siglec15基因?yàn)槔?，首先通過(guò)NCBI找到該基因有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本 NM_213602.3，將NM號(hào)或者CDS序列復(fù)制到網(wǎng)站（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）中。

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點(diǎn)擊RNAi Design，導(dǎo)出設(shè)計(jì)結(jié)果

注：若靶基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，則需要把所有NM號(hào)對(duì)應(yīng)的CDS序列進(jìn)行比對(duì)，得到共有序列CCDS，針對(duì)CCDS進(jìn)行設(shè)計(jì)。

目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)siRNA的干擾效率與mRNA中具體位置的關(guān)系，為確保對(duì)靶mRNA的有效抑制，針對(duì)每一個(gè)靶基因結(jié)合上述siRNA設(shè)計(jì)原則選擇靶點(diǎn)相差25bp以上的4星半以上的至少3條序列。隨后將siRNA片段進(jìn)行Blast分析，盡量選擇與靶基因特異結(jié)合的序列，進(jìn)行化學(xué)合成后，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)篩選出沉默效率最高的siRNA 序列進(jìn)行下一步的基因功能研究。

PS：有的siRNA序列在設(shè)計(jì)時(shí)沒(méi)有遵守這些指導(dǎo)方針，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明也具有很高的干擾效應(yīng)，這表明，我們只能根據(jù)上述指導(dǎo)方針設(shè)計(jì)出理論上具有較高沉默效應(yīng)的siRNA序列，siRNA的最終活性需要用實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證 。

以上就是本期內(nèi)容了，若對(duì)siRNA設(shè)計(jì)存在疑問(wèn)，歡迎咨詢(xún)漢恒生物！