前言

2021年12月歐易/鹿明生物合作客戶甘肅農(nóng)業(yè)大學孫萬倉教授課題組在Scientific Reports期刊發(fā)表的題為 “iTRAQ-Based Quantitative Proteome Analysis Insights into Cold Stress of Winter Turnip Rapa (Brassica rapa L.) Grown in the Field ”的研究成果，通過iTRAQ標記蛋白組學+轉錄組學研究方法，探究了莖尖分生組織的形態(tài)對冬油菜低溫耐受性中的作用。

中文標題：iTRAQ標記蛋白質(zhì)組學分析揭示了低溫脅迫對田間生長冬油菜的影響

研究對象：白菜型冬油菜

發(fā)表期刊：Scientific Reports

影響因子：4.17

發(fā)表時間：2021年12月6日

合作單位：甘肅農(nóng)業(yè)大學

運用生物技術：iTRAQ標記蛋白組學(由鹿明生物提供技術支持)、轉錄組學

研究背景

白菜型冬油菜（Brassica rapa L.）作為一種油料作物，可在中國北方寒冷干旱地區(qū)的冬季生存。因此，它在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有顯著的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。然而中國北方的極低溫度影響了其種植區(qū)域的分布和產(chǎn)量。高通量測序技術已成功鑒定了白菜型冬油菜和葉中參與冷應激反應性的miRNAs、差異表達基因（DEGs）和差異積累蛋白（DAPs）。此外，研究發(fā)現(xiàn)低溫敏感的白菜型冬油菜莖尖分生組織 (SAM) 形態(tài)突出，這使它們?nèi)菀资艿江h(huán)境波動的影響，從而不能越冬。相反，耐寒白菜型冬油菜的SAM降低，抗寒性較強。這表明 SAM 在調(diào)控植物耐寒性方面的具有重要作用。

研究思路

研究內(nèi)容

1. 研究材料

耐凍型Longyou 7和冷敏感型Lenox為材料

2. 研究方法

2.1形態(tài)學和生理學分析

2.2蛋白提取，蛋白質(zhì)消化

2.3 iTRAQ標記結合LC-MS質(zhì)譜分析：識別和定量細胞代謝變化

2.5統(tǒng)計分析：單因素方差分析(one-way ANOVA)分析，Duncan 's多重比較檢驗

2.6 RNA提取及基因表達qPCR分析

研究結果

生理發(fā)育和耐寒性

通過觀察低溫脅迫下Longyou 7和Lenox苗期植株的形態(tài)和生理差異發(fā)現(xiàn)，Longyou 7的葉柄和葉片幾乎匍匐生長，而 Lenox 的葉柄和葉片直立生長（圖1A）。之后測定了野外不同生長階段SAM水平的高度。與首次采樣(CK) 相比， Longyou 7和Lenox的SAM 的高度增加，且地表水平均高度的Lenox顯著高于Longyou 7（圖1B）。與L7 d和Le CK相比，L7 CK和Le CK樣品的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量均顯著降低。L7和Le CK組MDA含量顯著增加。冰凍處理(0℃和-11℃)下，Le CK和Le d的MDA水平顯著高于L7 CK和L7 d，Le CK和Le d的其他生理指標均低于L7 CK和L7 d(圖1C)。這些結果表明，與Lenox相比，Longyou 7的SAM更小，但耐寒性更高。在從田間試驗中發(fā)現(xiàn)Longyou 7等抗寒性強的品種的 SAM 較小，在土壤表面以下 5-10 厘米。因此，SAM位于溫度相對穩(wěn)定的遮蔽潮濕土壤中。這些結果表明幼苗SAM與耐寒性之間存在關聯(lián)。

圖1 |?(A) Longyou 7和Lenox的生長特性。(B)Longyou 7和Lenox的SAM和項圈形態(tài)。(C) Longyou 7和Lenox越冬后的生理指標。大寫表示有顯著性差異(p<0.01)。數(shù)值為3個生物重復的平均值和SD值，均由3個技術重復的平均值計算。

?iTRAQ標記蛋白組學分析

通過田間試驗，研究了Longyou 7和Lenox低溫馴化過程中的蛋白質(zhì)組學變化。以iTRAQ為基礎對Longyou 7和Lenox進行蛋白質(zhì)組定量分析。共鑒定出6328個蛋白(補充表S1)。

iTRAQ定量鑒定的DAPs

實驗發(fā)現(xiàn)當FC>1.5 (p<0.05)，DAPs累積增加，F(xiàn)C<0.8 (p<0.05)時，DAPs累積減少。在Le d /Le CK和L7 d /L7 CK之間有76個DAPs，在L7 d /Le d和L7 CK /Le CK之間有48個DAPs (圖2A和2B)。其中L7 d /L7 CK有35個DAPs。這與3個生物重復的主成分分析(PCA)結果一致，說明每個樣品的3個生物重復具有良好的重復性，L7 d /L7 CK和Le d /Le CK差異很大(圖2C)。如圖2D所示，L7 d /L7 CK中表達了111個DAPs，其中57個DAPs上調(diào)，54個DAPs下調(diào)(補充表S2)。L7 CK /Le CK共表達98個DAPs，其中29個DAPs上調(diào)，69個DAPs下調(diào)(補充表S3)。Le d /Le CK表達了183個DAPs，其中80個DAPs上調(diào)，103個DAPs下調(diào)(補充表S4)。在L7 d /Le d有107個DAPs表達，其中28個DAPs累積增加，79個DAPs累積減少(補充表S5)。

圖2 | (A) iTRAQ鑒定的L7 d / L7 CK與Le d / Le CK之間的DAPs Venn圖。(B)不同L7 d / Le d和L7 CK/ Le CK之間用iTRAQ鑒定的DAPs Venn圖。(C)低溫脅迫和凍害下冬油菜的3個生物重復蛋白質(zhì)組的主成分分析圖。(D)不同對照組的上下調(diào)蛋白數(shù)。

低溫響應DAPs的分類

通過UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫和基因本體論(GO)注釋對DAPs的功能進行了注釋。在本研究中，GO注釋到了2669個已知蛋白質(zhì)。根據(jù)GO分析結果對DAPs進行細胞成分、生物過程和分子功能的劃分(補充表S6)。如圖3所示，與Le d /Le CK相比，L7 d /L7 CK在前10個生物過程中對苯丙素和淀粉分解過程的響應是唯一的。L7 d /L7 CK在前10個生物過程中對蔗糖、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負調(diào)控、磷酸烯醇式丙酮酸轉運、光合作用調(diào)控和磷酸丙糖跨膜轉運的響應是唯一的。并且L7 d /L7 CK中淀粉分解過程均下調(diào)。

圖3 | (A) L7 d /L7 CK下調(diào)DAPs的GO富集分析。(B) L7 d /L7 CK中DAPs上調(diào)的GO富集分析。

為了進一步表征DAPs的功能，作者還進行了KEGG分析。KEGG富集分析顯示了L7 d /Le d之間DAPs的表達途徑，L7 d /Le d上調(diào)的DAPs在谷胱甘肽代謝、硫醇代謝、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝、脂肪酸降解、脂肪酸降解、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝和脂肪酸降解中富集。糖酵解/糖異生、氧化磷酸化、苯丙素生物合成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。L7 d / Le d中41個下調(diào)的DAPs主要是富含谷胱甘肽代謝，亞油酸的新陳代謝，亞麻酸，磷酸戊糖途徑等。

L7 d /L7 CK與Le d /L e CK相比，L7 d /L7 CK前20位的上調(diào)富集具有特殊型組氨酸代謝、轉換型戊糖和葡萄糖醛酸、代謝型嘧啶、代謝型甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、代謝型丙酮酸和RNA降解型。L7 d /L7 CK對下調(diào)富集前20的花生四烯酸代謝具有特異性(圖4)。

圖4 | (A) L7 d / L7 CK中下調(diào)的DAPs的Kyoto Encyclopedia of Genes和KEGG通路富集分析。(B) L7 d / L7 CK中上調(diào)的KEGG通路富集分析。

目標DAPs的qRT-PCR表達分析

利用qRT-PCR檢測了轉錄產(chǎn)物的表達水平(圖5)。本文隨機選取17個基因來驗證翻譯水平數(shù)據(jù)的可靠性。在2個品種中這17個基因表現(xiàn)出與蛋白水平幾乎相似的表達模式，僅MLP 328和ERD10的豐度與之相反，這可能是由于各種翻譯后修飾所導致的。

圖5 | DAPs相關基因的RT-qPCR分析。通過2?ΔΔCT的方法歸一化靶基因與β-肌動蛋白轉錄本的周期閾值差異，計算轉錄本豐度。

研究討論

本研究通過生理和蛋白質(zhì)組學分析在冬油菜中鑒定了大量的冷脅迫響應蛋白。探討了冬油菜耐凍性增強的機理和低溫脅迫對冬油菜形態(tài)和生理生化變化的影響。文章以耐凍型Longyou 7和冷敏感型Lenox為材料，通過iTRAQ標記蛋白組學和轉錄組學分析，揭示了谷胱甘肽轉移酶活性、碳水化合物結合和谷胱甘肽結合、代謝過程及IAA反應與冷應激反應密切相關，鑒定出了Longyou 7和Lenox之間的DAPs，這些DAPs參與氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)和能量代謝，對提高冬油菜的耐凍性發(fā)揮了重要作用。

小鹿推薦

冷脅迫響應蛋白在植物適應低溫環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。文章作者通過iTRAQ標記蛋白組分析對冬油菜耐冷脅迫的分子機制進行了研究。研究結果表明，DAPs參與氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)和能量代謝，這表明DAPs極大地改變了植物的耐凍性。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對抗凍分子機制的認識，有助于培育抗寒脅迫品種。此項研究體現(xiàn)了組學技術在機制研究中的重要作用。

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本文系鹿明生物原創(chuàng)

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