熒光蛋白在生物學(xué)眾多研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用， 基于熒光蛋白的分子探針和標(biāo)記方法已成為細(xì)胞或體內(nèi)動態(tài)成像研究生物大分子或細(xì)胞功能的重要工具。自1992年Shimomura 首次從水母 (Aequorea victoria) 中分離出綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)，各種顏色的熒光蛋白被開發(fā)出，它們能特異地 “點(diǎn)亮”生物分子或細(xì)胞，并顯示出生物分子的活動情況，從而能更有助于我們揭示這些分子或細(xì)胞的活動規(guī)律及本質(zhì)。

除了綠色熒光蛋白外（GFP），研究人員基于GFP運(yùn)用突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多種顏色的熒光蛋白，并從珊瑚和海葵等物種中克隆出光譜紅移的熒光蛋白，目前熒光蛋白按照顏色分類主要分為綠色系、藍(lán)色系、青色系、黃色系、橙色系和紅色系。

如何選擇熒光蛋白？

• ? ? ? 激發(fā)峰/發(fā)射峰

每一種熒光蛋白都有其獨(dú)特的激發(fā)波長和發(fā)射波長。因此，選擇的熒光蛋白必須是所用成像系統(tǒng)能夠激發(fā)和檢測到的。對于單色實(shí)驗(yàn)，綠色熒光蛋白是最常用的，選擇兩種或以上熒光蛋白進(jìn)行多色成像時，建議激發(fā)和峰值發(fā)射波長均相隔50-60nm以上。

對于兩種顏色， EGFP+mCherry幾乎在所有熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀上都能正常工作；對于三種顏色，藍(lán)色、綠色和紅色熒光蛋白組合（如TagBFP + EGFP + mCherry）或青色、黃色和紅色組合（例如CyPet + YPet + mCherry）可以很好的一起配合工作。

熒光蛋白應(yīng)用于活體成像實(shí)驗(yàn)時，盡量選擇紅色或近紅外的熒光蛋白，這類熒光蛋白的發(fā)射波長較長，具有更好的組織穿透能力。

• 單體性質(zhì)

將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，直接地追蹤目標(biāo)蛋白或是定位目標(biāo)蛋白，多聚體可能會影響融合蛋白的生物學(xué)功能或定位，應(yīng)盡量選擇單體。

• PK值

每個熒光蛋白都有其最合適的 pH 值，即在一定的pH 值下，熒光強(qiáng)度最高。有的熒光蛋白適合在酸性環(huán)境下使用，相反有的適合在堿性環(huán)境下使用，因此在選擇熒光蛋白時需要考慮熒光蛋白的 PK 值。

在細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)細(xì)胞器內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)的 pH 值都在 7.0 左右，然而溶酶體內(nèi)的 pH 值就比較低，mCherry的 PK值比較低，可以用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白。

在選擇熒光蛋白時，要考慮目標(biāo)蛋白定位環(huán)境的 pH 值，再考慮使用相應(yīng) PK 值的熒光蛋白。

• 亮度

熒光蛋白的亮度值由消光系數(shù)與量子產(chǎn)率的乘積計算得出。在許多情況下，將熒光蛋白的亮度與EGFP(設(shè)定為1)進(jìn)行比較（見上表），應(yīng)選擇足夠亮的熒光蛋白便于檢測和成像。

• 光穩(wěn)定性

熒光蛋白在發(fā)光的同時會被漂白，逐漸失去發(fā)光能力，因此要想獲得更多的信息，就需要熒光的光穩(wěn)定性好。在普通的熒光成像中，對熒光蛋白的光穩(wěn)定性要求并不是很高，比如激光共聚焦顯微鏡成像時，熒光信號的穩(wěn)定性只需要能保證采集的完整的一張圖即可。而在超分辨熒光成像中，對熒光蛋白的光穩(wěn)定性要求比較高。

• 成熟時間

熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊等步驟，其中折疊過程占據(jù)了大部分時間，此過程被稱之為成熟時間。成熟時間較長的熒光蛋白不適合標(biāo)記短壽命的蛋白，因?yàn)榭赡苣繕?biāo)蛋白開始降解時，熒光蛋白還沒有發(fā)光，導(dǎo)致無法追蹤及定位目標(biāo)蛋白。因此在選擇熒光蛋白時，需要考慮其成熟時間。

• 融合位置

熒光蛋白的融合位置（N 端或C端）主要取決于目的蛋白折疊過程中，熒光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質(zhì)的折疊。如果標(biāo)記的目的蛋白是一個新的蛋白，可分別進(jìn)行N端和C端融合表達(dá)，以此來進(jìn)行選擇最后的融合位置。

為什么表達(dá)的熒光蛋白亮度較低？

在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過程中，可能會遇到表達(dá)的熒光蛋白亮度很低的情況，除了盡量選擇亮度較高的熒光蛋白外，還有可能是以下幾種原因?qū)е碌模?/p>

• 啟動子

不同啟動子誘導(dǎo)熒光蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱不同，如UBC啟動子只能誘導(dǎo)熒光蛋白的弱表達(dá)，可按實(shí)驗(yàn)要求選擇廣譜性或者組織特異性的強(qiáng)啟動子，如EF1α、CAG。另外注意有些啟動子，如廣譜性強(qiáng)啟動子CMV在體外細(xì)胞中能很好地誘導(dǎo)表達(dá)，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時則會沉默。

• 表達(dá)方式（融合/非融合）

熒光蛋白與目的蛋白的表達(dá)方式包括融合表達(dá)和非融合表達(dá)。融合表達(dá)多用于目的蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白互作探究，但融合蛋白表達(dá)的熒光亮度通常低于單獨(dú)的熒光蛋白，融合表達(dá)時，熒光蛋白可能出現(xiàn)錯誤折疊等現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測不到熒光信號或熒光較弱。

• 連接原件

非融合表達(dá)主要用于檢測目的基因表達(dá)水平，一般選擇連接肽Linker，如2A肽或IRES將ORF分隔開。選擇IRES，下游ORF的表達(dá)明顯弱于上游ORF（約為上游的10%-20%），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尤為明顯。選擇2A肽，應(yīng)考慮其切割效率受上下游ORF序列的影響，常選擇P2A和T2A，P2A切割效率最高（某些情況高達(dá)100％）。

熒光蛋和熒光素酶的區(qū)別

熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠催化熒光素產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是來自螢火蟲體內(nèi)(Firey)和海腎(Renilla)體內(nèi)的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。熒光蛋白和熒光素酶是在基因工程中廣泛使用的兩個報告基因 (reportergene),除了來源不同之外，他們主要在發(fā)光原理、檢測方法和用途方面均有不同。

• 發(fā)光原理

熒光蛋白例如GFP是用藍(lán)紫光激發(fā)即能發(fā)出肉眼清晰可見的綠色熒光 , 無需任何底物或輔助因子；而熒光素酶本身不發(fā)光，是通過與底物進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)后釋放出光子。

• 檢測方法

GFP發(fā)出的熒光很容易通過紫外燈 、共聚焦顯微鏡 (confocalmicroscope)、熒光顯微鏡或熒光激活的細(xì)胞分揀器 (fluoresenceactivatedcell sorter, FACS)分析而在活細(xì)胞中被檢測到。在普通熒光顯微鏡下 ,以藍(lán)光或紫光激發(fā) ,再選擇合適的濾光片 ,就可以看到細(xì)胞發(fā)出的 GFP熒光 。熒光素酶的活性定量檢測通常使用液閃儀或生物發(fā)光測定儀 (luminometer)，在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下 ,加入超量的底物 , 在一定的時間間隔內(nèi)熒光的閃爍總數(shù)與同樣品中存在的熒光素酶的活性總量成正。另外,也可以采用光自顯影法對熒光素酶進(jìn)行定性檢測 。

• 用途

熒光蛋白可與蛋白的N端或C端融合表達(dá)而不影響各自功能，可用于觀察融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置，可以方便地從大量細(xì)胞或組織中篩選出來。但熒光蛋白的定量分析僅限于陰性/陽性兩個結(jié)果，而熒光素酶就能夠定量地得到表達(dá)量/表達(dá)水平的數(shù)值，鑒于此，研究者利用熒光素酶開發(fā)出一套極其靈敏且使用方便的基因報告系統(tǒng)，被廣泛用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動子活性分析、miRNA與靶基因相互作用分析、活體成像、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域。