歐易單細胞測序客戶文章停不下來！今天為大家解讀的是12月18日由天津大學海河醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗部陳懷永主任課題組在Cellular and Molecular Life Sciences （IF 9.261）?期刊發(fā)表的關于LKB1缺失從而調控氣道goblet cell化生的相關成果。李玉老師、張秋陽老師和李莉主任為文章的第一作者，文章特別致謝了歐易生物巴永兵和唐旋在單細胞測序分析中提供的相關支持。

?基本信息?

材料：3只Nkx2.1Cre;Lkb1f/f和Lkb1f/f小鼠的肺組織

期刊：Cellular and Molecular Life Sciences

發(fā)表時間：2021年11月

方法：歐易生物10× Genomics scRNA-seq

?研究背景和研究目的?

goblet cell分化失控是許多呼吸系統(tǒng)疾病的顯著特征，包括哮喘、囊性纖維化和慢性阻塞性肺?。–OPD）。粘蛋白高分泌可阻止粘液纖毛清除并減少氣體交換。但現(xiàn)有的COPD藥物，包括支氣管擴張劑和抗炎類固醇，都沒有以goblet cell分化和粘液分泌為目標，這些藥物只能抑制慢性阻塞性肺病癥狀而無法治療病情。因此，靶向氣道goblet cell化生是一種可能減少COPD癥狀的新策略。而腫瘤抑制肝激酶B1（ LKB1）是一種重要的干細胞/祖細胞增殖和分化調控因子，本研究期望通過在氣道祖細胞中恢復LKB1的表達從而限制goblet cell分化和粘液的高分泌來治療COPD。

?研究內容概述?

在本研究中，作者首先表明了LKB1的表達量在COPD患者和暴露在香煙煙霧中的小鼠肺中均下調。Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠條件性Lkb1缺失的肺上皮表現(xiàn)出氣道粘液高分泌和肺巨噬細胞浸潤。隨后，作者對Nkx2.1Cre;Lkb1f/f和Lkb1f/f小鼠的肺組織進行scRNA-seq分析，進一步發(fā)現(xiàn)LKB1缺失后氣道goblet cell分化發(fā)生改變。此外，類器官培養(yǎng)研究表明，小鼠氣道（棒狀）祖細胞中Lkb1缺失可上調FIZZ1/RELM-α的表達，從而促進氣道goblet cell分化和肺巨噬細胞招募?；趕cRNA-seq分析，作者還發(fā)現(xiàn)Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠肺中單核來源的巨噬細胞表現(xiàn)出交替激活的M2表型，同時表達RELM-α，從而加劇氣道goblet cell化生。細胞通訊分析結果顯示LKB1介導的氣道祖細胞和巨噬細胞之間的相互作用可調節(jié)氣道goblet cell化生。綜上所述，LKB1激動劑可能作為一種潛在的治療選擇，用于治療與goblet cell化生相關的呼吸系統(tǒng)疾病。

?具體研究內容解析?

1.COPD患者氣道上皮中LKB1的表達下調

Figure 1. COPD患者肺部LKB1表達下調

作者從公開的GEO數(shù)據(jù)集（GSE106986）中檢索了14名COPD患者和5名健康對照者的轉錄組數(shù)據(jù)。分析顯示，與正常對照組相比，COPD患者的肺勻漿中LKB1的表達顯著降低（Figure 1A）。相應的，從數(shù)據(jù)集（GSE125521）中檢索的暴露在香煙煙霧中的小鼠轉錄組數(shù)據(jù)也顯示出類似的結果（Figure 1B）。免疫組化染色結果也顯示，在COPD患者的肺上皮中LKB1水平明顯降低（Figure 1C）。此外，在COPD患者中觀察到goblet cell化生以及巨噬細胞積累（Figure 1C-D）。

2.肺上皮中敲除Lkb1促進goblet cell化生

Figure 2. 上皮細胞Lkb1缺失導致氣道goblet cell化生和炎癥反應

為了明確LKB1是否調控goblet cell的分化，作者將Lkb1f/f小鼠與Nkx2.1Cre小鼠進行雜交產生Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠，其中LKB1在胚胎和成年小鼠肺上皮中特異性缺失。研究結果表明，在出生后第2周，Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠比對照組體型更小且體重少增加10-25%（Figure 2A）。出生后第5周，Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠死亡（Figure 2B）。肺部組織學檢查顯示支氣管周圍結締組織有大量炎癥細胞浸潤，氣道上皮增厚（Figure 2C）。與對照組相比，Nkx2.1Cre支氣管內黏液細胞數(shù)量明顯增加，阿爾新藍染色顯示Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠支氣管內黏液細胞數(shù)量明顯增加（Figure 2D）。全肺RT-qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，LKB1缺失時Foxj1表達降低，而Scgb1a1和ClCa3的表達則明顯升高（Figure 2E）。這些數(shù)據(jù)表明Lkb1限制了肺部goblet cell的分化。

Figure 3. 單細胞RNA-seq分析顯示刺激goblet cell分化

為了探究LKB1缺失誘發(fā)的肺病理機制，作者對5周齡Nkx2.1Cre;Lkb1f/f和Lkb1f/f小鼠肺進行了scRNA-seq分析，經質控后共獲得30,408個肺細胞并基于已有的marker基因，鑒定了各cluster的細胞類型：包括上皮（Epcam）；內皮（Cdh5，Myct1）；成纖維細胞（Col1a2，Ogn）；髓系細胞（Trem2）；中性粒細胞（Retnlg，Mmp9）；紅系和紅系前體細胞（Alas2）；B細胞（CD19）；ILC （Il1rl1），自然殺傷細胞（Ccl5，Klre1）；T cells （CD3d）（Figure 3A-B）。

隨后，作者著重研究了上皮細胞，首先利用各上皮亞型marekr基因將上皮細胞分為6個亞型：AT2細胞（Abca3，Sftpc）；AT1細胞（Aqp5，Pdpn）；基底細胞（Trp63，Krt5）；club cell（Cyp2f2，Scgb1a1，Cdhr3，F(xiàn)oxj1）；goblet cell（Foxa3,?Spdef）；神經內分泌細胞（Chga，Ascl1）（Figure 3C-D）。其次對Nkx2.1Cre;Lkb1f/f和同窩對照小鼠的肺上皮細胞做了組間差異表達基因網(wǎng)絡分析，結合數(shù)據(jù)庫，上皮源性LKB1相關肺疾病按所示疾病相關的基因數(shù)排序，證實了LKB1是腫瘤抑制因子（Figure 3E）。擬時序分析揭示了club cell向goblet cell的分化軌跡，分析顯示幾乎所有映射到club cell分化軌跡的goblet cell均來自Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠，證實了LKB1在goblet cell分化中的抑制作用（Figure 3F）。

Figure 4. club cell中敲低Lkb1的分子效應

KEGG富集分析和SCENIC分析顯示，Janus激酶/信號轉導器和轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路可能受Lkb1影響（Figure 4A-B）。隨后作者發(fā)現(xiàn)與正常club cell相比，LKB1缺失的club cell中Stat3表達上調（Figure 4B-C）。而免疫熒光染色結果也表明LKB1缺失的club cell中磷酸化的STAT3表達上調（Figure 4D）。這些數(shù)據(jù)表明STAT3可能參與了Club細胞命運決定。

3.Club細胞中敲除Lkb1可上調RELM?α的表達，該基因可調節(jié)goblet cell分化

Figure?5.?Lkb1敲低可上調RELM-α的表達從而使club cell分化為goblet cell

為了研究LKB1調控club cell向goblet cell分化的分子機制，作者針對Nkx2.1Cre;Lkb1f/f和同窩對照小鼠的club cell進行了差異分析，結果顯示，在LKB1缺失的情況下，club cell和goblet cell中的Retnla表達水平均增加，同時粘液分泌相關和炎癥相關基因如Muc5b、Chil3、Cd9和Tnfaip3的表達上調?（FC > 1.5；p < 0.05）（Figure5A）。這些數(shù)據(jù)表明Retnla可能調節(jié)goblet cell的分化。共聚焦顯微鏡顯示Retnla編碼的RELM-α蛋白在正常小鼠的club cell和goblet cell中均未被檢測到（Figure5B）。然而，在Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠的肺中，發(fā)現(xiàn)RELM-α上調并與Cyp2F2（club cell marker）和Muc5Ac（goblet cell marker）共定位（Figure5B）。綜上表明LKB1抑制club cell中RELM-α的表達。

此外，為了明確RELM-α是否還調節(jié)goblet cell的分化，作者利用流式細胞術從C57BL/6小鼠中分離出具有CD31?CD34?CD45?EpCAM+?Sca1+CD24low表型特征的club cell，然后與支持性肺成纖維細胞進行類器官培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)，重組RELM-α存在時，club cell衍生類器官的大小和形成效率保持不變，表明RELM-α對club cell增殖作用不大。然而，基于qRT-PCR分析，在添加了重組RELM-α的類器官培養(yǎng)物中，goblet cell marker基因（Muc5Ac、ClCa3和Foxa3）的表達量上調（Figure5C）。綜上所述，RELM-α可促進goblet cell分化。

4.上皮細胞敲除Lkb1誘導巨噬細胞積累和激活

Figure 6.?Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠氣道club cell周圍巨噬細胞分離

有研究顯示RELM-α可驅動單核細胞的招募，促進肺巨噬細胞的選擇性激活。為了研究RELM-α的上調是否導致巨噬細胞的積累和激活，作者使用Chil3/Ym1、Muc5Ac和Cyp2F2抗體對肺切片進行免疫熒光染色，結果觀察到Ym1+巨噬細胞聚集在氣道Cyp2F2+細胞周圍（Figure6A）。

為了進一步研究巨噬細胞是否影響club cell向goblet cell的分化，作者利用流式細胞儀從C57BL/6小鼠肺組織中分離出CD11b+巨噬細胞，并與club cell按1:2的比例共培養(yǎng)（Figure6B）。qPCR結果顯示，在有巨噬細胞存在的類器官培養(yǎng)中，goblet cell marker基因Clca3、Muc5ac、Spdef的表達上調（Figure6C）。隨后，基于scRNA-seq數(shù)據(jù)，作者首先將肺髓系細胞細分為：樹突狀細胞（Irf8，Clec9a）；單核細胞（Adgre4）；巨噬細胞（Mrc1，Hmox1）（Figure6D），并發(fā)現(xiàn)Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠肺中巨噬細胞數(shù)量比對照組小鼠多（Figure6E），這與上述結果一致。為了研究這些巨噬細胞的起源，作者又對巨噬細胞做了進一步劃分：肺駐留巨噬細胞被鑒定為表達Siglecf、Marco和Pparg的亞群；單核細胞來源的巨噬細胞被鑒定為高表達Mafb、Itgam和Apoe的亞群（Figure6F）。一些單核細胞來源的巨噬細胞表達Retnla、Arg1和Chil3, 這表明他們的M2表型是交替激活的。此外，在Nkx2.1Cre;Lkb1f/f小鼠中可見M2巨噬細胞，而對照小鼠中則無（Figure6E）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，上皮細胞LKB1的抑制誘導單核細胞招募到肺部，并促使其M2表型的激活。

為了進一步了解在Lkb1缺失的情況下，巨噬細胞的起源如何影響club cell的分化，作者針對巨噬細胞與club cell以及巨噬細胞與goblet cell之間做了細胞通訊分析。結果顯示，club cell與單核細胞來源的巨噬細胞的通訊方式不同于其與駐留的巨噬細胞的通訊方式。例如，單核細胞來源的巨噬細胞對小鼠club cell的分化有較大的影響（Figure7A）。總之，這些數(shù)據(jù)表明LKB1是調節(jié)氣道goblet cell分化的抑制因子，Lkb1缺失可上調氣道祖細胞RELM-α的表達，從而促進氣道goblet cell分化和肺巨噬細胞的浸潤（Figure7B）。

?歐易點評?

本篇文章中，作者采用了scRNA-seq分析、類器官培養(yǎng)、轉基因和免疫染色技術來研究LKB1對肺goblet cell化生的作用。本文亮點是利用scRNA-seq技術為探究LKB1缺失誘發(fā)的肺病理機制以及LKB1調控club cell向goblet cell分化的分子機制提供基礎，并結合濕實驗最終證實巨噬細胞來源的RELM-α有助于氣道goblet cell化生的進一步發(fā)展。在分析手段上，本篇文章尤其在差異表達基因、擬時序、SCENIC和細胞通訊分析的運用上具有很好的參考意義。

?文獻鏈接?

PMID:?34921639

DOI: 10.1007/s00018-021-04044-w

?參考文獻?

Li, Y., Zhang, Q., Li, L. et al. LKB1 deficiency upregulates RELM-α to drive airway goblet cell metaplasia. Cell. Mol. Life Sci. (2021).

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單細胞事業(yè)部? 撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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