2022年12月6日，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院彭文輝教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF:17.694）在線發(fā)表了題為“Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis”的研究論文。該研究為與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的細(xì)胞外捕捉途徑填補(bǔ)了空白，研究結(jié)論揭示了血管平滑肌細(xì)胞重編程后發(fā)揮的相關(guān)功能，為精準(zhǔn)化靶向干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化方向從而治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供了理論依據(jù)。

期刊：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表年月：2022-12-06

材料：分別取自B6-G/R Myh11Pad4小鼠和B6-G/R Myh11小鼠(每組6只)的主動(dòng)脈

方法：10x Genomics單細(xì)胞3端測序

研究背景

細(xì)胞外捕捉現(xiàn)象(ETs)是一種先天免疫反應(yīng)，細(xì)胞將DNA釋放到細(xì)胞外空間，形成由解聚染色質(zhì)、瓜氨酸化組蛋白和細(xì)胞蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。ETs的形成最早是由Brinkmann等人在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，被認(rèn)為是一種消滅微生物的有效防御反應(yīng)。

近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外捕捉在非傳染性和無菌性疾病中也有重要作用，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎等，并且除中性粒細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞也可以產(chǎn)生細(xì)胞外捕捉。但目前對(duì)于細(xì)胞外捕捉在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究顯示其影響了動(dòng)脈粥樣硬化，但動(dòng)脈粥硬化并非依賴中性粒細(xì)胞來源的途徑，因此探索是否存在其他細(xì)胞來源的細(xì)胞外捕捉途徑對(duì)動(dòng)脈粥硬化的進(jìn)展研究有相當(dāng)意義。

研究結(jié)果

Result1 巨噬細(xì)胞是晚期斑塊中細(xì)胞外捕捉的重要來源

作者比較了小鼠主動(dòng)脈根部中性粒細(xì)胞(NETs)和巨噬細(xì)胞(METs)產(chǎn)生的ETs ，發(fā)現(xiàn)所有METs或NETs的釋放都與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的演變密切相關(guān)。重要的是，在晚期斑塊中，ETs主要與巨噬細(xì)胞相關(guān)，而并非中性粒細(xì)胞（圖1）。這表明在晚期斑塊中，由血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）轉(zhuǎn)化而來的巨噬細(xì)胞是細(xì)胞外捕捉的重要來源。

圖1

Result2?VSMCs譜系追蹤技術(shù)顯示CD68+ VSMCs產(chǎn)生ETs

為了追蹤ETs+ CD68+ VSMCs的起源，作者建立了VSMCs譜系追蹤小鼠模型B6-G/R Myh11Cre，發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)的Tdtomato+ VSMCs比正常主動(dòng)脈內(nèi)側(cè)層的Tdtomato+ VSMCs表達(dá)更高水平的PAD4 ，說明VSMCs在動(dòng)脈粥樣硬化條件下可能產(chǎn)生ETs。

Result3 Ox-LDL可刺激CD68+ VSMCs體外產(chǎn)生ETs

油紅O染色和CCK8結(jié)果顯示72 h時(shí)陽性細(xì)胞比例最高，存活率最高(圖2a-c)。與對(duì)照組相比，膽固醇負(fù)載的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(RASMCs)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平更高，VSMCs收縮標(biāo)志物表達(dá)水平降低(圖2d)，WB也證實(shí)了α-SMA和CD68蛋白水平的變化(圖2e-g)。同時(shí)，與對(duì)照組相比，裝載膽固醇的RASMCs具有更多的吞噬生物顆粒和更高的吞噬基因表達(dá)。

隨后作者分別比較了PDGF誘導(dǎo)的RASMCs、轉(zhuǎn)分化RASMCs和去分化RASMCs中PADs家族mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PAD家族成員中PAD4大多升高。通過WB和IF(圖2k)，發(fā)現(xiàn)膽固醇負(fù)載后，PAD4在RASMCs中的表達(dá)大幅上調(diào)。氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)被廣泛研究為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的危險(xiǎn)因素，作者發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以誘導(dǎo)CD68+ VSMCs體外生成ETs。

圖2

Result4 VSMCs缺乏PAD4會(huì)減少脂肪條紋的形成和不穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步明確血管平滑肌細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞外捕捉對(duì)斑塊進(jìn)展的影響，作者構(gòu)建了三基因敲除小鼠(Myh11/B6G/Pad4)并制成動(dòng)脈粥樣硬化模型，發(fā)現(xiàn)VSMCs中僅缺失PAD4導(dǎo)致病變尺寸在24周時(shí)顯著減小了(圖3b-f)，Myh11Pad4小鼠血漿dsDNA濃度也降低了(圖3g)，α-SMA、CD68和H3CIT的IF染色顯示，VSMCs中PAD4的抑制抑制了Myh11Pad4中CD68+VSMCs釋放的ETs，而不改變頭臂動(dòng)脈（BCA）損傷或主動(dòng)脈根部損傷中髓系巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ETs（圖3h–l ）。α-SMA、CD68和H3CIT的IF染色顯示，VSMCs中PAD4的抑制抑制了Myh11Pad4中CD68+VSMCs釋放的ETs（P＜0.01），而不改變頭臂動(dòng)脈（BCA）損傷或主動(dòng)脈根部損傷中髓系巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ETs（圖3h–l ）。這種變化確實(shí)降低了CD68+細(xì)胞總數(shù)中CD68+VSMCs的比例。

與對(duì)照組小鼠相比，作者觀察到壞死面積減少（圖3m，n），纖維面積增加（圖3o，p），CD68+面積減少（見圖3q，r），Myh11Pad4小鼠的BCA損傷或主動(dòng)脈根部損傷中MMP9+面積減少（圖3s、t）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，在來自人吸入性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的三個(gè)樣本中，ETs由CD68+VSMCs產(chǎn)生，ETs陽性CD68+VSMCs的區(qū)域與一系列相鄰切片中的MMP9陽性區(qū)域相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CD68+VSMCs對(duì)于晚期斑塊中ETs的產(chǎn)生至關(guān)重要，這在加速斑塊的不穩(wěn)定性和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖3

Result5 VSMCs的特異性PAD4缺乏會(huì)減少ETs的產(chǎn)生，并影響VSMCs的轉(zhuǎn)分化

?Myh11Pad4小鼠中CD68+ VSMCs的比例低于Pad4小鼠，作者推測，巨噬細(xì)胞總數(shù)的降低可能與ETs減少導(dǎo)致CD68+ VSMCs減少有關(guān)。因此，作者以B6-G/R Myh11小鼠作為對(duì)照，生成VSMCs譜系追蹤小鼠B6-G/R Myh11Pad4?(圖4a)。在B6-G/R Myh11CrePad4flox/flox小鼠中，抑制斑塊大小和脂質(zhì)含量也得到了類似的結(jié)果(圖4b, c)。此外，與對(duì)照組相比，B6-G/R Myh11CrePad4flox/flox組血漿中dsDNA濃度也較低(圖4d)。由此可見，ETs是由CD68+ VSMCs釋放的，而非去分化的VSMCs釋放的，并且ETs在VSMCs向CD68+ VSMCs轉(zhuǎn)分化中起著至關(guān)重要的作用，從而影響斑塊負(fù)擔(dān)和穩(wěn)定性。

Result6 ScRNA-seq結(jié)合vsmcs譜系追蹤技術(shù)揭示了抑制ETs釋放后細(xì)胞映射的變化

為了深入了解PAD4缺失對(duì)VSMCs轉(zhuǎn)分化的影響，作者對(duì)混合的Tdtomato+細(xì)胞和ZsGreen+細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq。質(zhì)控后，共獲得35,511個(gè)細(xì)胞，降維聚類后得到10個(gè)Cluster。scRNA-seq結(jié)果顯示，在VSMCs PAD4缺陷時(shí)，Tdtomato+細(xì)胞表達(dá)格局發(fā)生了巨大變化，而ZsGreen+細(xì)胞映射的演變則微乎其微（圖4h-j）。

Result7 CD68+ VSMCs產(chǎn)生的ETs影響VSMCs由有益樣細(xì)胞向有害樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方向

作者對(duì)Tdtomato+細(xì)胞進(jìn)行亞聚類獲得了10個(gè)cluster（圖4K、L），敲除PAD4后，衰老VSMCs的比例顯著減少(圖4m)。衰老VSMCs聚類顯示Vcam1和Ccl2高表達(dá)，GO富集分析結(jié)果為“SMC凋亡進(jìn)展”，SMCs標(biāo)記基因在“平滑肌細(xì)胞分化”中富集，纖維肌細(xì)胞和纖維軟骨細(xì)胞(有益細(xì)胞)的標(biāo)記基因在“肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育”中富集，參與斑塊穩(wěn)定過程。此外，PAD4 (hi) CD68+ SMC、CD68+ SMC和衰老SMC簇的標(biāo)記基因在“炎癥反應(yīng)到損傷”(圖5a所示)中富集，產(chǎn)生炎癥和不穩(wěn)定。根據(jù)一系列發(fā)現(xiàn)作者得出結(jié)論，抑制cd68陽性VSMCs的ETs促進(jìn)了B6-G/R Myh11Pad4小鼠斑塊發(fā)展過程中VSMCs向有益細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。

圖四

Result8 PAD4 (hi) CD68+ VSMCs通過釋放ETs和激活STING-SOCS1或TLR4信號(hào)通路影響周圍VSMCs

作者篩選了從B6-G/R Myh11Pad4小鼠(Pad4 Tdtomato+細(xì)胞)中獲得的Tdtomato+細(xì)胞與從B6-G/R Myh11小鼠(Pad4+/+ Tdtomato+細(xì)胞)中獲得的Tdtomato+細(xì)胞的不同表達(dá)基因(DEGs)(圖5b)。GSEA顯示B6-G/R Myh11 Tdtomato+細(xì)胞中，“toll樣受體信號(hào)通路”、“STING信號(hào)通路”和“TNF信號(hào)通路”產(chǎn)生了富集。

隨后，作者對(duì)H3CIT + dsDNA組和bsa處理對(duì)照組的rasmc進(jìn)行了批量RNA測序分析。圖5c, d顯示了兩組細(xì)胞之間不同的基因表達(dá)模式。作者在oxLDL刺激的不同時(shí)間點(diǎn)用H3CIT和dsDNA處理RASMCs，發(fā)現(xiàn)H3CIT中STAT3的磷酸化被抑制，而dsDNA與對(duì)照組相比，STING上調(diào)(圖5e-g)。接著作者發(fā)現(xiàn)Socs1是STING信號(hào)通路激活后抑制STAT3磷酸化的關(guān)鍵調(diào)控因子。IF染色顯示Ki67+ Tdtomato+ SMCs比例降低。此外，抑制ETs釋放后，體內(nèi)Socs1表達(dá)的IF染色顯著降低(圖5l, m)。

RASMCs中TLR4- myd88信號(hào)通路也被激活(圖5h-j)， B6-G/R Myh11Pad4小鼠斑塊抑制ETs釋放后，TLR4調(diào)控的下游蛋白GSDMD減少(圖5k, n, o, )，在B6-G/R Myh11小鼠的VSMCs中，tlr4誘導(dǎo)SMCs增殖，這與之前的scRNA-seq結(jié)果一致。

圖五

文章總結(jié)

作者研究表明，CD68+ VSMCs產(chǎn)生的ETs不利于斑塊的進(jìn)展，并強(qiáng)調(diào)了它們?cè)诎邏K穩(wěn)定中的意外作用。這些發(fā)現(xiàn)也為VSMCs轉(zhuǎn)分化為不同的中間有害和有益亞型提供了見解，這些亞型可能影響斑塊的組成，并可作為預(yù)防斑塊的新治療靶點(diǎn)。

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35330-1