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《Science》2月3日發(fā)表文章，報(bào)道日本理化學(xué)研究所(理研)生命醫(yī)科學(xué)研究中心的古關(guān)明彥教授、千葉大學(xué)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞分子醫(yī)學(xué)的大日向康秀講師等人在世界上首次成功建立“原始內(nèi)胚層干細(xì)胞(primitive endoderm stem cell；PrES細(xì)胞)”。

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這項(xiàng)研究成果將有助于闡明僅由幾十個(gè)細(xì)胞組成的早期胚胎能夠產(chǎn)生個(gè)體生命的機(jī)制，并可能在未來(lái)實(shí)現(xiàn)僅僅使用干細(xì)胞就可以在試管中重建早期胚胎的工作。

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在小鼠體內(nèi)，受精卵3天后，形成囊胚，這是已經(jīng)可以分出三種細(xì)胞，即未來(lái)形成胚胎的細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)、成為胎盤的細(xì)胞(滋養(yǎng)層細(xì)胞)以及成為卵黃囊的細(xì)胞(原始內(nèi)胚層細(xì)胞)。此前，人類已經(jīng)培養(yǎng)了胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）和滋養(yǎng)干細(xì)胞（TS細(xì)胞），但是培養(yǎng)出有功能的PrES細(xì)胞這還是第一次。

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聯(lián)合研究小組發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠胚泡，可以建立PrES細(xì)胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)將PrES細(xì)胞注入囊胚后，迅速進(jìn)入原始內(nèi)胚層，有助于卵黃囊的派生。另外，將PrES細(xì)胞注入到原始內(nèi)胚層缺失的胚泡中（原本應(yīng)該很早就死亡的胚胎），結(jié)果所有的原始內(nèi)胚層序列組織形成了，最終誕生了正常的小鼠。

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背景

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我們的生命只從一個(gè)受精卵開(kāi)始，受精卵重復(fù)卵裂，最終形成稱為“囊胚”的早期胚胎。囊胚主要是由數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的組織，具有衍生胚胎的“表囊”、衍生胎盤的“滋養(yǎng)膜”、衍生卵黃囊的“原始內(nèi)胚層”三個(gè)細(xì)胞系譜。在小鼠受精后10天內(nèi)卵黃囊是必要的，以支持胚胎發(fā)育。

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到目前為止，雖然人類從表囊中建立了ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)，從滋養(yǎng)膜中建立了TS細(xì)胞(滋養(yǎng)干細(xì)胞)，但還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)殘留的原始內(nèi)胚層干細(xì)胞(primitive endoderm stem cell；PrES細(xì)胞)的建立。

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另外，近年來(lái)，僅使用干細(xì)胞重組胚胎的研究備受關(guān)注，但僅靠以往的ES細(xì)胞和TS細(xì)胞，制作囊胚的“部件”不夠，必須要建立殘留的PrES細(xì)胞。

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囊胚由表囊(紅)、營(yíng)養(yǎng)膜(綠)、原始內(nèi)胚層(藍(lán))3種，共數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成(左)。胚胎來(lái)自表囊，胎盤來(lái)自營(yíng)養(yǎng)膜，卵黃囊(壁側(cè)內(nèi)胚層、臟層內(nèi)胚層、交界區(qū)內(nèi)胚層)來(lái)自原始內(nèi)胚層。

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研究方向與成果

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聯(lián)合研究小組將小鼠胚胎泡置于不同的培養(yǎng)條件下，并探索建立和維持PrES細(xì)胞的條件。結(jié)果，通過(guò)向無(wú)血清培養(yǎng)基中添加糖原合成酶3(GSK3)抑制劑CHIR99021、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF4、抗凝血藥肝素、血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF-AA 4，成功建立了PrES細(xì)胞。

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對(duì)建立的PrES基因分析發(fā)現(xiàn)，同ES細(xì)胞、TS細(xì)胞都表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式，與受精后第4.5天胚胎形成后不久的原始內(nèi)胚層非常相似。

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接下來(lái)，將PrES細(xì)胞注入囊泡以分析PrES細(xì)胞的功能，細(xì)胞迅速進(jìn)入原始內(nèi)胚層。原始內(nèi)胚層是派生壁側(cè)卵黃囊的壁側(cè)內(nèi)胚層、臟卵黃囊的臟層內(nèi)胚層、邊界區(qū)域內(nèi)胚層的組織。將注入PrES細(xì)胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宮中，PrES細(xì)胞有助于壁側(cè)內(nèi)胚層、臟層內(nèi)胚層、交界區(qū)內(nèi)胚層的全細(xì)胞派生，囊胚細(xì)胞和PrES細(xì)胞混合，最終發(fā)現(xiàn)它維持了胚胎形成的能力。

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作者還研究了將PrES細(xì)胞注入缺失原始內(nèi)胚層的胚泡中是否可以防止胚胎死亡，結(jié)果顯示PrES細(xì)胞衍生出所有原始內(nèi)胚層序列的組織，并產(chǎn)生了一窩正常的小鼠。這一結(jié)果意味著PrES細(xì)胞具有補(bǔ)充原始內(nèi)胚層的能力。

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PrES細(xì)胞的建立使構(gòu)成囊胚的所有細(xì)胞的干細(xì)胞聚集在一起(圖2)。

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ES細(xì)胞主要形成胚胎，TS細(xì)胞主要形成胎盤，PrES細(xì)胞主要形成卵黃囊。三種干細(xì)胞聚集在一起，覆蓋了所有的受孕產(chǎn)物。

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作者還研究了在試管內(nèi)組合三個(gè)干細(xì)胞是否可以人工制造胚樣結(jié)構(gòu)。通過(guò)使用特殊培養(yǎng)皿，依次組合培養(yǎng)ES細(xì)胞、TS細(xì)胞、PrES細(xì)胞，然后對(duì)制作的組織(ETP復(fù)合體)進(jìn)行單一細(xì)胞基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)可以在一定程度上再現(xiàn)胚胎著床前后的過(guò)程。將ETP復(fù)合體移植到假妊娠小鼠的子宮中，移植的復(fù)合體中有30%左右著床。然后在懷孕7.5天，發(fā)現(xiàn)它形成了一個(gè)類似于由壁側(cè)內(nèi)胚層樣和臟層內(nèi)胚層樣的雙重卵黃囊包圍的胚胎結(jié)構(gòu)(圖3)。

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左：ETP復(fù)合物移植到假妊娠小鼠子宮后，衍生出胚樣結(jié)構(gòu)。左邊是明視野，右邊是綠色熒光蛋白(GFP)，顯示PrES細(xì)胞的貢獻(xiàn)。虛線表示ETP復(fù)合體和子宮的邊界。

中：左是正常受精的第7.5天胚胎，右邊是從ETP復(fù)合物衍生的妊娠7.5天胚樣結(jié)構(gòu)。ETP胚樣結(jié)構(gòu)被內(nèi)胚層標(biāo)記SOX17陽(yáng)性(紅色)雙重卵黃囊樣片包圍。Hoechst(藍(lán)色)是DNA染色。

右：放大了中間那個(gè)方形部分的圖像。從右邊ETP復(fù)合物衍生的胚樣結(jié)構(gòu)顯示壁側(cè)內(nèi)胚層樣(PE-like)和臟層內(nèi)胚層樣(VE-like)。

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評(píng)述和期待

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作者古關(guān)明彥表示："本研究有助于我們了解由幾十個(gè)細(xì)胞組成的囊胚如何發(fā)揮生命起源的功能。我們還在研究與人類細(xì)胞更相似的豬細(xì)胞，希望能有所突破。

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京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所的Yasuhiro Takashima教授認(rèn)為這是一個(gè)非常有趣的結(jié)果。讓人類可以更好理解卵黃囊在胚胎生長(zhǎng)中的作用，未來(lái)我們可以將從小鼠身上獲得的知識(shí)用于人類。

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當(dāng)前，不使用類似自然的精子和卵子形成的胚胎，而是僅僅利用干細(xì)胞來(lái)制造人工胚胎的研究，是目前世界生物領(lǐng)域競(jìng)爭(zhēng)最為激烈的領(lǐng)域。無(wú)論在美國(guó)、澳大利亞還是日本，都在你追我趕的在該領(lǐng)域爭(zhēng)取早日取得突破。

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此次日本的研究，標(biāo)志著人類首次培養(yǎng)成功PrES細(xì)胞，意味著人工胚胎的制作和人工生命的研究邁出了重要一步。

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參考文獻(xiàn)：Yasuhide Ohinata*，Takaho A.Endo，Hiroki Sugishita，Takashi Watanabe，Yusuke Iizuka，Yurie Kawamoto，Atsunori Saraya，Mami Kumon，Yoko Koseki，Takashi Kondo，Osamu Ohara，Haruhiko Koseki，“Establishment of mouse stem cells that can recapitulate the develeScience,?10.1126/science.aay 3325

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