常見的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，是基于gRNA與目的基因互補(bǔ)配對將其錨定在Cas9蛋白的特定結(jié)構(gòu)域上，RuvC 的結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)非互補(bǔ)鏈的切割，切割的位點(diǎn)位于 PAM 的 5’端的第三個堿基 外側(cè)，而中部類似于 HNH 的結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)互補(bǔ)鏈的切割，從而實(shí)現(xiàn)基因片段的敲除。

常用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)電轉(zhuǎn)方法是將 gRNA 和 Cas9 蛋白孵育結(jié)合為 RNP，電轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞中，進(jìn)行雙 sgRNA 片段敲除?；蛘呖刹捎觅|(zhì)?；虿《巨D(zhuǎn)導(dǎo)將雙sgRNA與 Cas9 基因構(gòu)建在同一載體中使其轉(zhuǎn)導(dǎo)入目的基因所在的細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)片段敲除。

技術(shù)原理圖

初步鑒定敲除細(xì)胞系是否構(gòu)建成功，需鑒定其DNA水平。片段敲除可有如下的鑒定策略（圖1）。設(shè)計引物PCR擴(kuò)增三個區(qū)域，分別為gRNA-A1作用的區(qū)域（Region 1藍(lán)色框區(qū)域, ?gRNA-A2作用的區(qū)域(Region 2綠色框區(qū)域）和敲除區(qū)域（Region 3 黑色框區(qū)域）。如果gRNA作用的區(qū)域無法擴(kuò)增出條帶，而完整的敲除區(qū)域擴(kuò)增出比野生型小的條帶，則說明該細(xì)胞系在基因組水平上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了敲除。

PCR鑒定位點(diǎn)如下圖

Region 1 (WT:643 bp; 雜合子:643 bp; 純合子: 0 bp)

Region 2 (WT:958 bp; 雜合子:958 bp; 純合子: 0 bp)

Region 3 (WT:5577 bp; 雜合子:5577/~637 bp; 純合子: ~637 bp)

作者：Cas9x海星生物

公眾號：海星生物科技

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