來源??TMR Publishing Group

作者??Medical Data Mining 編輯部??

肺癌是最常見的癌癥之一，發(fā)病率和死亡率高。肺癌的亞型大致可分為兩類，非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌。NSCLC占這兩種亞型的85%，可進一步分為鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌，而肺腺癌（LUAD）最為常見。然而，LUAD患者的5年總生存率僅為15%。許多研究表明，lncRNAs可以影響腫瘤微環(huán)境（TME），影響腫瘤浸潤和進展。因此，識別新的高效的腫瘤生物標志物對LUAD的精確診斷、靶向治療和預(yù)后預(yù)測至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。壞死是一種新建立的細胞程序性死亡方法，在抗腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。因此，識別與壞死相關(guān)的長鏈非編碼RNA并基于其來評估肺腺癌的特征對于患者的生存預(yù)測和治療至關(guān)重要。

研究方法

本文從公共數(shù)據(jù)庫中收集數(shù)據(jù)，并進行LASSO分析，構(gòu)建一個13-lncRNA預(yù)后模型。基于共識聚類、估計、序列排序和加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析來識別免疫特征。

研究結(jié)果

預(yù)后壞死相關(guān)lncRNA的鑒定

本研究的工作流程如圖1所示。本文對56個壞死相關(guān)基因進行單因素Cox回歸分析。最終獲得了19個預(yù)后相關(guān)基因，包括FADD、MLKL、TRIM11、IPMK、MYC、TNFRSF1A、TRAF2、PANX1、MAP3K7、diablo、ID1、HSPA4、FLT3、HAT1、PLK1、ALK、TERT、HSP90AA1、DDX58。然后，進行了相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)>0.4和P<0.001）來篩選與壞死相關(guān)的lncRNA。共鑒定出267個lncRNAs，其中與壞死相關(guān)的lncRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)如圖2A所示。本文采用單因素Cox分析來確定壞死和預(yù)后相關(guān)的lncRNAs，最終鑒定出41個lncRNAs（P<0.05）（圖2B）。41個lncRNA在腫瘤和正常樣本中的表達譜如圖2C所示。

預(yù)后壞死相關(guān)lncRNA的共識聚類

基于41個預(yù)后與壞死相關(guān)的lncRNAs，本文對所有LUAD樣本進行了共識聚類分析，以探討41個lncRNAs的表達特征與LUAD亞型之間的關(guān)系。根據(jù)經(jīng)驗累積密度函數(shù)圖，當k=2時，一致性聚類矩陣顯示，LUAD樣本可以分為兩個亞型（圖3A）。根據(jù)共識聚類分析結(jié)果，本研究接下來比較了基于聚類（聚類1和聚類2）的臨床信息。性別、N分期和腫瘤分期均有顯著性差異（圖3B）。此外，為了進一步探討兩個亞組之間的差異，聚類1和聚類1的Kaplan-Meier生存曲線顯示，兩個亞組的OS存在差異。結(jié)果顯示，集群2的操作系統(tǒng)優(yōu)于集群1（圖3C）。

集群1和集群2亞組的免疫檢查點和TME簽名

為了探討LUAD的兩組亞組的TME特征，本文對免疫檢查點進行了相關(guān)性分析。PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、PDCD1LG2（PD-L2）、CTLA4和LAG3與預(yù)后壞死相關(guān)的lncRNA（圖4A）。本文還比較了不同聚類中免疫檢查點的表達水平（圖4B-圖4F）。結(jié)果顯示，除CTLA4外，其他4個免疫檢查點均存在表達差異，且聚類1的表達水平均高于聚類2。此外，為了評估不同集群免疫激活的程度，本文進一步用ESTIMATE算法計算TME分數(shù)，表明集群1的免疫分數(shù)低于集群2而兩者基質(zhì)得分和估計分數(shù)沒有顯著差異（圖4G-圖4I）。

免疫細胞浸潤分析、WGCNA和GO集群分析

為了評估免疫細胞浸潤條件，本文應(yīng)用CIBERSORT算法來評估LUAD中免疫細胞的比例。圖5A顯示了簇1和2的22個免疫細胞浸潤。結(jié)果顯示，同時結(jié)合免疫細胞具有較高的分數(shù)水平，本文最終發(fā)現(xiàn)漿細胞、T細胞CD8、巨噬細胞M0和巨噬細胞M1在簇1中較高。相反，T細胞CD4、巨噬細胞M2、樹突狀細胞、樹突狀細胞激活和肥大細胞在簇2中較高。

為了進一步探索不同聚類中基因表達模式的特征，本文利用WGCNA算法來識別聚類1和聚類2的特征。根據(jù)WGCNA結(jié)果，本文確定MEGrey模塊與聚類的相關(guān)性最高（相關(guān)系數(shù)=0.56，P<0.001）（圖5B）。因此，本文從MEGrey模塊中篩選了前30個模塊內(nèi)連接基因，包括ANXA10、ASCL1、ALCA、CDHR2、CDHR5、CSAG1、CSAG3、DDX3Y、EIF1AY、EPS8L3、FER1L6、HNF4A、KDM5D、MAGEA12、MAGEA3、MAGEA6、MT-ATP6、MT-CO1、MT-CO2、MT-CO2、MT-CO3、MT-CYB、MT-ND2、MT-ND4、MT-ND4L、MYO1A、REG4、RPS4Y1、USP9Y、UTY、ZFY。

然后，進行WGCNA分析，鑒定前30個基因的功能特征。GO分析結(jié)果顯示，CDHR2與豐富的通路具有較高的連通性（圖5C）。接下來，進行了Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示CDHR2高表達組的OS時間比LUAD的低表達組差（P=0.033）（圖5D）。隨后，本文進一步驗證了CDHR2在人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫的表達狀態(tài)，顯示CDHR2高抗體染色在一些免疫組化樣本和高CDHR2表達水平的預(yù)后狀況不良，這表明CDHR2是LUAD患者的預(yù)后樞紐基因（圖5e）。

基于預(yù)后壞死相關(guān)lncRNA的LUAD預(yù)后模型的開發(fā)和驗證

共將494份TCGA lncRNAs矩陣的腫瘤樣本，按7：3的比例隨機分為訓(xùn)練集（348）和測試集（146）。根據(jù)之前篩選的41個與預(yù)后壞死相關(guān)的lncRNA，我們利用lasso回歸和10倍交叉驗證來過濾預(yù)后模型的變量（圖6A，圖6B）。最后，建立了13個lncRNAs構(gòu)建模型。在該模型中，有5個基因（LINC02693、FGD5-AS1、TMPO-AS1、LINC01116、LINC02802）具有正系數(shù)，表明這些基因是對LUAD患者的有害因素。與此相反，8個基因（RHOQ-AS1、LINC02273、LINC01800、LINC00996、CADM3-AS1、SFTA3、CRNDE、PARP11-AS1）具有負系數(shù)，對LUAD患者的預(yù)后具有保護作用，其較高的表達水平往往意味著較好的預(yù)后?；谠擄L(fēng)險預(yù)后模型，我們根據(jù)中位數(shù)風(fēng)險評分將其分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。對兩組患者進行Kaplan-Meier生存分析，log-rank檢驗顯示低危組預(yù)后較好（P<0.001，圖6C）。然后繪制1年、3年和5年的ROC曲線，估算模型的預(yù)測效率，并計算曲線下面積（AUC），分別為0.75、0.7、0.67（圖6D）。

隨后，為了檢驗該模型的預(yù)后預(yù)測效果，本文進行了風(fēng)險評分。我們在中位數(shù)風(fēng)險分界值將樣本分為高和低風(fēng)險組，并比較了兩組的生存差異，繪制了ROC曲線，計算了1、3、5年的AUC。結(jié)果顯示，兩組在生存率上有顯著差異，低風(fēng)險組的預(yù)后優(yōu)于高風(fēng)險組（P=0.002，圖6E）。1、3、5年ROC曲線的AUC分別為0.66、0.6和0.78（圖6F）。結(jié)果表明，該模型具有良好的預(yù)測效果。

對模型的外部驗證和獨立的預(yù)后分析

為了進一步確認該模型的有效性，我們從GEO數(shù)據(jù)庫上驗證了該模型，其中包括來自GPL570平臺的289個樣本。同樣，采用Kaplan-Meier生存分析，比較高危組和低危組的生存差異，顯示高危組預(yù)后較差（圖7A）。此外，1年、3年和5年的ROC曲線的AUC分別為0.68、0.64和0.61（圖7B）。這些結(jié)果表明，該模型在LUAD患者的預(yù)后生存預(yù)測方面具有良好的性能。

為了驗證我們的模型是否可以作為一個獨立于其他臨床特征的獨立預(yù)后因素，我們在整個LUAD TCGA數(shù)據(jù)集中結(jié)合臨床信息對該模型進行了獨立的預(yù)后分析。首先，單因素獨立預(yù)后分析顯示，年齡和性別與生存無關(guān)，但風(fēng)險評分和腫瘤分期與生存相關(guān)（圖7C）。然后，進行多變量獨立預(yù)后分析，表明風(fēng)險評分和腫瘤分期可以獨立于其他因素作為獨立的預(yù)后因素（圖7D）。綜上所述，基于模型的風(fēng)險評分和腫瘤分期是影響預(yù)后的獨立因素，而年齡和性別則不是獨立的預(yù)后因素。因此，我們建立的模型可以作為LUAD預(yù)后的獨立預(yù)后因素。

模型中差異表達基因的篩選及基于風(fēng)險評分的聚類特征識別

本文使用“l(fā)imma”軟件包分析差異表達基因（lncRNAs）。最后，本研究證實了SFTA3在腫瘤組中表達下調(diào)。用盒圖比較其在腫瘤組和正常組中的表達水平，顯示SFTA3在正常組中表達較高，但在腫瘤組中的表達較低（圖8A）。根據(jù)之前的Cox回歸分析（圖2B），SFTA3的危險比為0.842，這提醒我們，檢測SFTA3低表達可能是LUAD診斷的必要標志物。

此外，為了更深入地研究LUAD的多重性狀。我們根據(jù)模型的風(fēng)險評分，比較了聚類中的差異。結(jié)果顯示，聚類1的風(fēng)險評分高于聚類2，這與我們之前的研究一致，即聚類1的預(yù)后比聚類2差（圖3C，圖8B）。結(jié)合我們之前的研究，聚類1的免疫評分低于聚類2（圖4H），這可以解釋為什么聚類1預(yù)后較差——因為聚類1處于低免疫浸潤狀態(tài)，導(dǎo)致患者高危，預(yù)后不良。因此，這些發(fā)現(xiàn)提示免疫過程在LUAD的進展中起著重要的作用。

結(jié)論

本文構(gòu)建了一個新的與13個壞死相關(guān)的lncRNA模型，并識別了LUAD患者的免疫特征，可應(yīng)用于臨床評估患者的預(yù)后，為LUAD的治療提供新的思路。

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引用格式

Xia P, Wang DG, Ouyang SW, et al. Based on necroptosis identifying the immunological features and prognostic signatures of lung adenocarcinoma.?Med Data Min. 2022;5(2):8. doi:10.53388/MDM20220520008

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