寫在前面

????????今天推薦的是由美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)戴維斯心肺研究所生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)系在2019年7月1日發(fā)表于EBioMedicine（2020IF：8.143，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Yutong Zhao教授，研究表明去泛素化酶USP13穩(wěn)定抗炎受體IL-1R8/Sigirr以抑制肺部炎癥。

研究背景

????????白細(xì)胞介素-1（IL-1）相關(guān)受體（Sigirr），也被稱為IL-1R8，已被證明對(duì)包括急性肺損傷在內(nèi)的炎癥性疾病有廣泛的抗炎作用，而IL-1R8/Sigirr蛋白穩(wěn)定性的分子調(diào)控尚未有報(bào)道。本研究旨在研究一種去泛素化酶（DUB）對(duì)IL-1R8/Sigirr的穩(wěn)定是否足以抑制炎癥反應(yīng)和減輕肺部炎癥。

摘要部分

????????作者發(fā)現(xiàn)IL-1R8/Sigirr的降解是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過(guò)位點(diǎn)特異性泛素化介導(dǎo)的。這種作用被USP13所抑制。USP13的水平與IL-1R8/Sigirr直接相關(guān)，這兩種蛋白在受TLR4激動(dòng)劑脂多糖（LPS）炎癥損傷的小鼠的細(xì)胞和組織中都有所減少。細(xì)胞中的USP13被敲低后，IL-1R8/Sigirr的多泛素化增加，其穩(wěn)定性降低，這增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子的釋放。同樣，USP13缺陷的小鼠對(duì)LPS或銅綠假單胞菌模型的肺部炎癥損傷高度敏感。IL-1R8/Sigirr在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)或通過(guò)肺部病毒轉(zhuǎn)染降低了USP13-/-基因型導(dǎo)致的炎癥表型。

研究?jī)?nèi)容

1.Sigirr在蛋白酶體中被降解? ? ? ?

????????IL-37已被確定為Sigirr的唯一配體。作者測(cè)試了IL-37是否會(huì)調(diào)節(jié)Sigirr的豐度。用IL-37處理MLE12小鼠肺上皮細(xì)胞或人巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sigirr總蛋白水平下降，但I(xiàn)L-18R1沒(méi)有下降。用抗Sigirr抗體的流式細(xì)胞儀分析顯示，IL-37隨著時(shí)間的推移降低了其在細(xì)胞表面的豐度。這些結(jié)果表明，Sigirr被IL-37內(nèi)化和降解是研究Sigirr降解的分子機(jī)制的一個(gè)合適的分子模型。為了研究蛋白酶體或溶酶體途徑是否參與了Sigirr的降解，作者在IL-37處理前用蛋白酶體（MG-132）或溶酶體活性的抑制劑（leupeptin）孵育MLE12細(xì)胞。MG-132，但不是leupeptin，阻止了Sigirr的降解，表明Sigirr降解不發(fā)生在溶酶體中。此外，Sigirr在蛋白合成抑制劑環(huán)己酮（CHX）存在下的半衰期被MG-132延長(zhǎng)，進(jìn)一步表面蛋白體降解是細(xì)胞Sigirr消除的主要途徑。

????多泛素化可以通過(guò) Lys (K)48-、K63-和其他泛素鏈連接來(lái)表征，作者發(fā)現(xiàn)K48而非K63連接的泛素鏈?zhǔn)荢igirr修飾的主要模式。泛素鏈通常被添加到底物蛋白的賴氨酸殘基上。為了確定Sigirr內(nèi)的泛素接受點(diǎn)，作者用精氨酸替換了人類Sigirr的幾個(gè)K殘基。這些K-R突變確定了Sigirr的K163殘基是IL-37介導(dǎo)的推定泛素受體殘基，因?yàn)榕cWT或其他Sigirr的K-R突變體相比，SigirrK163R沒(méi)有被降解，并顯示泛素化的減少。

研究結(jié)論：Sigirr可以被K48連接的泛素鏈在K163殘基上泛素化，以響應(yīng)IL-37的連接，導(dǎo)致其蛋白體降解。

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2.USP13去泛素化并穩(wěn)定Sigirr

????????由于DUBs去除泛素鏈，它們可以抑制降解信號(hào)以穩(wěn)定底物蛋白。作者進(jìn)行了一個(gè)篩選，以確定負(fù)責(zé)穩(wěn)定Sigirr的DUB。只有V5標(biāo)記的USP13的異位表達(dá)明顯減少了Sigirr的降解。三種針對(duì)小鼠USP13 mRNA的shRNA有效地將Sigirr蛋白水平降低了約70-90%，同樣，人類USP13 siRNA也將BEAS-2B人類上皮細(xì)胞中的Sigirr蛋白降低了約80%。敲低USP13并不影響Sigirr mRNA轉(zhuǎn)錄水平，表明USP13穩(wěn)定Sigirr蛋白而不改變其基因表達(dá)。USP13-V5的過(guò)量表達(dá)削弱了MLE12細(xì)胞中的Sigirr泛素化，而用shRNA敲低USP13增強(qiáng)了Sigirr泛素化，表明USP13對(duì)Sigirr進(jìn)行去泛素化以穩(wěn)定該蛋白。

研究結(jié)論：USP13去泛素化并穩(wěn)定Sigirr。

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3.USP13與Sigirr相關(guān)

????????接下來(lái)，作者使用免疫熒光染色評(píng)估了USP13-Sigirr 關(guān)聯(lián)。MLE12細(xì)胞與HA標(biāo)記的Sigirr和USP13-V5共轉(zhuǎn)染。Sigir-HA和USP13-V5高度共定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞質(zhì)中也觀察到一些斑點(diǎn)。Co-IP還揭示了USP13與Sigirr的關(guān)聯(lián)。DUB 和跨膜受體蛋白之間的關(guān)聯(lián)可以通過(guò)連接進(jìn)行調(diào)節(jié)。USP13和Sigirr的復(fù)合物在IL-37處理后被破壞，表明IL-37通過(guò)減少其與USP13的結(jié)合來(lái)增加Sigirr泛素化。為了進(jìn)一步鑒定 Sigirr上的USP13結(jié)合區(qū)域，作者將純化的USP13-HA與一系列Sigirr-V5 的C端缺失突變體一起孵育。Co-IP分析顯示SigirC端的290-374aa區(qū)域是其與USP13結(jié)合所必需的。

研究結(jié)論：USP13與Sigirr有相互作用。

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4.USP13通過(guò)穩(wěn)定Sigirr抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

????????為了研究USP13在炎癥反應(yīng)中的生物學(xué)功能，作者首先證實(shí)了Sigirr的抗炎活性。Sigirr的過(guò)量表達(dá)削弱了LPS誘導(dǎo)的JNK、ERK和IL-6基因表達(dá)的磷酸化。LPS誘導(dǎo)NF-κB和MAPK信號(hào)以介導(dǎo)炎癥信號(hào)和細(xì)胞因子的釋放。USP13的過(guò)量表達(dá)削弱了LPS誘導(dǎo)的I-κB的磷酸化和降解、p38的磷酸化，以及LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中IL-6的釋放。用shRNA或siRNA下調(diào)USP13可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的I-κB的磷酸化和降解、p38的激活、NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位和IL-8的釋放。為了確定USP13對(duì)LPS信號(hào)的抑制作用是否取決于其活性，作者在293TLR4細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)了USP13的無(wú)催化活性突變體（C345A）。USP13 C345A沒(méi)有減弱LPS誘導(dǎo)的p38的磷酸化，而是增加了p38的磷酸化，這表明USP13的酶活性是抑制LPS信號(hào)傳導(dǎo)所必需的。

研究結(jié)論：USP13在LPS處理的細(xì)胞中表現(xiàn)出抗炎活性。

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5.USP13因體外和體內(nèi)內(nèi)毒素處理而減少

????????LPS誘導(dǎo)后，在RAW 264.7細(xì)胞和MLE12細(xì)胞中，USP13和Sigirr都隨著時(shí)間的推移而被降低。在小鼠急性肺損傷模型中，氣管內(nèi)用LPS或銅綠假單胞菌（PA103菌株）處理后，小鼠肺部勻漿中的USP13和Sigirr水平也同樣下降。免疫組化染色顯示，肺上皮細(xì)胞中的USP13減少，這與H&E染色和IL-1β豐度顯示的炎癥損傷增加相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，USP13在急性炎癥損傷期間是下調(diào)的。作者評(píng)估了LPS誘導(dǎo)的USP13下調(diào)的可能分子機(jī)制，并觀察到USP13 mRNA水平被LPS降低，表明LPS刺激減少了USP13的轉(zhuǎn)錄。作者隨后測(cè)試了幾個(gè)下游途徑，對(duì)NF-κB、JNK和p38途徑的藥物阻斷并不影響LPS介導(dǎo)的USP13的減少。

研究結(jié)論：內(nèi)毒素處理能夠在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)USP13蛋白水平降低。

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6.Usp13 缺陷小鼠加劇LPS或銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肺部炎癥

????????為了研究USP13在炎癥反應(yīng)中的相關(guān)性，作者使用CRISPR/Cas9生成Usp13缺陷小鼠。作者發(fā)現(xiàn)來(lái)自Usp13-/-?小鼠的肺組織裂解物中有接近USP13分子量的微弱條帶，可能來(lái)自未發(fā)現(xiàn)的 Usp13 剪接突變體。與作者的細(xì)胞 USP13 敲低研究一致，來(lái)自 Usp13-/-小鼠的肺中的Sigir水平顯著減少。作者假設(shè) Usp13-/-小鼠會(huì)表現(xiàn)出增強(qiáng)的炎癥，作者通過(guò)氣管內(nèi)施用LPS或銅綠假單胞菌（PA103 菌株）對(duì) Usp13-/-小鼠或 Usp13+/+?(WT) 小鼠進(jìn)行測(cè)試。與 WT 小鼠相比，Usp13-/-?小鼠LPS處理后6小時(shí)或銅綠假單胞菌感染后4小時(shí)，USP13-/-小鼠表現(xiàn)出明顯更大的細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是中性粒細(xì)胞。H&E 染色顯示，小鼠的炎癥損傷增加，并且BAL液中TNF-α、IL-1β和IL-6釋放增加。這些數(shù)據(jù)表明，USP13的缺失促進(jìn)了肺損傷小鼠模型中的肺部炎癥。

研究結(jié)論：炎癥環(huán)境中USP13的減少可能在一定程度上促成了肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

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7.Sigirr在Usp13-/-小鼠中逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的急性肺部炎癥

????????為了研究在Usp13-/-小鼠身上觀察到的炎癥增強(qiáng)是否是由于Sigirr的失調(diào),作者構(gòu)建了Sigirr的慢病毒載體，并注射到WT或Usp13-/-小鼠的氣管內(nèi)，五天后用LPS注射小鼠。Western blot證實(shí)了Sigir在Lenti-Sigirr感染的小鼠肺部組織中的表達(dá)。Lenti-Sigirr轉(zhuǎn)導(dǎo)有效地抑制了Usp13-/-動(dòng)物中觀察到的增強(qiáng)的LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥表型，細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞、TNF-α和IL-1β減少。

研究結(jié)論：由USP13耗竭引起的促炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，部分是由于Sigirr的不穩(wěn)定。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者提出了一個(gè)以USP13作為Sigirr穩(wěn)定性的正向調(diào)節(jié)器的工作模型，表明USP13活性有利于保持抗炎IL-37-Sigirr活性，同時(shí)炎癥期間兩種蛋白質(zhì)的豐度降低。USP13去泛素化酶活性逆轉(zhuǎn)Sigirr多泛素化，并穩(wěn)定Sigirr蛋白以保留抗炎信號(hào)?；谶@些信息，可以通過(guò)增強(qiáng)USP13活性來(lái)穩(wěn)定Sigirr，這可能是阻止肺部炎癥的有效策略。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.011