前言

多發(fā)性硬化（MS）是一種主要影響年輕人的神經(jīng)炎癥和脫髓鞘中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病。它由一系列廣泛的免疫成分組成，這些免疫成分使中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的軸突髓鞘退化。盡管在過去二十年中，MS免疫調(diào)節(jié)藥物的研究和開發(fā)出現(xiàn)了巨大的熱潮，但沒有令人滿意的治療方法可以為患者提供長期康復(fù)治療。大多數(shù)藥物的最大挑戰(zhàn)是嚴(yán)重的副作用和較差的耐受性。因此，迫切需要識別新的分子靶點(diǎn)并利用免疫途徑轉(zhuǎn)化為MS治療。

2022年6月，亨利福特醫(yī)療集團(tuán)在Proc Natl Acad Sci USA（IF：12.779）上發(fā)表的題為“Blood-based untargeted metabolomics in relapsing-remitting multiple sclerosis revealed the testable therapeutic target”的研究成果，本研究使用非靶向代謝組學(xué)，測量了35名復(fù)發(fā)緩解性多發(fā)性硬化癥（RRMS）患者和14名健康對照組的血清代謝物，發(fā)現(xiàn)RRMS患者的甘油磷脂、檸檬酸鹽循環(huán)、鞘磷脂和丙酮酸鹽代謝這四條代謝途徑發(fā)生顯著改變。而為這四條途徑提供能量的共同上游代謝途徑是糖酵解途徑，隨后通過實(shí)時(shí)生物能量分析顯示與糖酵解有高度相關(guān)，為RRMS治療提供新的參考。

研究背景

代謝組學(xué)可以為生物體內(nèi)發(fā)生的瞬時(shí)生理或病理變化進(jìn)行檢測，因此利用代謝組學(xué)表征和識別RRMS患者血清樣本中受干擾的代謝途徑，并使用藥理學(xué)方法以其為靶點(diǎn)，使用經(jīng)典的臨床前MS小鼠模型研究其在疾病進(jìn)展中的治療潛力。

研究思路

研究結(jié)果

1.與健康受試者相比，RRMS患者表現(xiàn)出明顯的血清代謝特征

為了確定與RRMS疾病狀態(tài)相關(guān)的代謝特征，作者對33名RRMS患者和14名年齡和性別匹配的健康受試者（HS）的血清進(jìn)行了非靶向整體代謝分析。結(jié)果鑒定到632個(gè)代謝物（圖1），其中60個(gè)代謝物在HS和RRMS組間發(fā)生顯著改變（P<0.05，F(xiàn)DR<0.10），變化最大的代謝物屬于脂質(zhì)（46%）和外源物質(zhì)（20%）代謝途徑，其次是肽（12%）、氨基酸（7%）、維生素（5%）、碳水化合物（5%）、能量（3%）和核苷酸代謝途徑（2%）。作者采用因果網(wǎng)絡(luò)分析（CNA）發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)鞘氨醇-1-磷酸受體2（S1PR2或S1P2）預(yù)測是在疾病期間被激活的主要調(diào)節(jié)因子之一。

為了進(jìn)一步了解與改變的代謝物相關(guān)的信號節(jié)點(diǎn)和通路，作者還進(jìn)行了通路分析（IPA），結(jié)果顯示鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸代謝最顯著的途徑。三項(xiàng)分析均顯示與鞘氨醇-1-磷酸代謝的共同代謝途徑相關(guān)，已知其在調(diào)節(jié)MS炎癥中起關(guān)鍵作用。因此，作者對RRMS患者的代謝分析證實(shí)并驗(yàn)證了代謝產(chǎn)物的改變反映了疾病的生物學(xué)過程。

圖1 | 與HS相比，RRMS患者的代謝輪廓發(fā)生改變

Metscape分析結(jié)果顯示，與HS相比，RRMS患者的富集到的通路網(wǎng)絡(luò)更加豐富（圖2）。包括糖酵解、三羧酸循環(huán)（TCA）、尿素、嘌呤、酪氨酸、丁酸、磷脂酰肌醇磷酸酯、甘油鞘脂、嘧啶、氨基糖、蛋氨酸和半胱氨酸等代謝途徑，在MS疾病期間受到很大影響，并反映在血液中（圖2）。Kegg通路分析，發(fā)現(xiàn)顯著富集到甘油磷脂代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA）、鞘脂代謝和丙酮酸代謝途徑。

圖2 | 生物信息學(xué)分析確定糖酵解是RRMS中改變的代謝途徑的上游

根據(jù)上述分析作者發(fā)現(xiàn)糖酵解作為上游代謝途徑與RRM存在關(guān)聯(lián)性（圖2），與HS相比，RRMS-PBMC的糖酵解活性顯著增加（圖3）。在EAE的臨床前小鼠模型中也重復(fù)了這一觀察結(jié)果，與對照組（CFA）相比，EAE組的PBMC表現(xiàn)出更高水平的糖酵解（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)明確表明，來自MS患者及其臨床前小鼠的PBMC以更高的速率進(jìn)行糖酵解。

圖3 | RRMS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和臨床前小鼠模型（EAE）中觀察到較高的糖酵解活性

2.與HS相比，RRMS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的糖酵解增加

作者對HS和RRMS患者衍生的PBMCs進(jìn)行了糖酵解反應(yīng)分析，以細(xì)胞外酸化率（ECAR）來衡量。HS和RRMS的PBMCs都對各種應(yīng)激源做出了反應(yīng)，并給出了典型的糖酵解曲線（圖3 A）。然而，與HS相比，RRMS的PBMCs基礎(chǔ)糖酵解明顯較高（P<0.05），表明RRMS的PBMCs的糖酵解活性有內(nèi)在的增加（圖3 A）。這一觀察結(jié)果也在EAE的臨床前小鼠模型中得到了復(fù)制，EAE組的PBMC與CFA組相比，表現(xiàn)出更高的糖酵解水平（圖3 B）。這些發(fā)現(xiàn)明確顯示，多發(fā)性硬化癥患者和其臨床前小鼠的PBMCs進(jìn)行糖酵解的速度增加。

3.使用 2-脫氧葡萄糖治療靶向糖酵解改善了臨床前 EAE 小鼠模型中的疾病進(jìn)展

由于糖酵解在PBMCs中上調(diào)，并成為調(diào)節(jié)、連接、傳輸RRMS患者的四條改變的代謝途徑的上游代謝途徑，但是抑制糖酵解是否會(huì)影響MS疾病的進(jìn)展尚不明確。于是作者采用2-脫氧葡萄糖（2DG），一種非代謝性的葡萄糖類似物和競爭性的己糖激酶抑制劑，用SJL小鼠在復(fù)發(fā)緩解的MS臨床前模型來研究糖酵解抑制的效果。用蛋白脂蛋白（PLP）免疫EAE的小鼠，從免疫后第6天開始每天用2DG治療，而對照組則注射PBS。用2DG治療可顯著降低疾病的嚴(yán)重程度（P<0.01），但不影響疾病的發(fā)生（圖4 A）。與PBS組相比，用2DG治療也能消除治療組的復(fù)發(fā)（P＜0.001，圖4 A）。

在另外兩種EAE小鼠模型中也觀察到類似的療效，2DG不僅能有效地延緩疾病的發(fā)生，而且還能降低疾病的嚴(yán)重程度（（P<0.001），圖4 B、C）。作者還研究了EAE模型中通過飲水口服2DG時(shí)的效果，與未治療組相比，用2DG治療的組別顯示出疾病發(fā)生的延遲和疾病嚴(yán)重程度的降低（圖4 D），表明2DG對減少EAE小鼠模型的疾病進(jìn)展有積極影響。脊髓切片染色顯示，浸潤的單核細(xì)胞（MN）數(shù)量減少，髓鞘再生，這反映了治療后EAE臨床評分的下降（圖4 E、F）。

此外，與PBS治療的EAE小鼠相比，2DG治療組的脫髓鞘現(xiàn)象也得到了明顯緩解。因此作者認(rèn)為在MS疾病的臨床前模型中，2DG治療可以減少免疫細(xì)胞的浸潤，防止病變的發(fā)展，并促進(jìn)髓鞘再生。

圖4 | 靶向能量途徑改善EAE小鼠模型的疾病進(jìn)展

此外，為了研究2DG對髓鞘特異性免疫反應(yīng)的影響，作者在免疫后第20天從2DG處理組和載體EAE組分離出脾臟細(xì)胞，用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）刺激它們72小時(shí)。96小時(shí)后用細(xì)胞增殖試驗(yàn)（Promega）檢查細(xì)胞增殖情況，并將細(xì)胞上清液用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，查看兩組的炎癥細(xì)胞因子狀況。與未經(jīng)處理的EAE組相比，2DG處理明顯減少了抗原特異性細(xì)胞增殖，降低了IFN-γ、白細(xì)胞介素（IL）17和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的水平，并誘導(dǎo)了IL-10的產(chǎn)生（圖5 A）。與蛋白水平相一致，qPCR數(shù)據(jù)顯示，所有細(xì)胞因子的信使RNA表達(dá)都因2DG處理而減少（圖5 B）。

為了研究2DG介導(dǎo)的EAE保護(hù)的潛在機(jī)制，作者量化了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中浸潤的MN細(xì)胞的絕對數(shù)量和它們產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子的能力。觀察到，2DG治療明顯減少了浸潤的MN細(xì)胞（CD45+）和CD4 T細(xì)胞（CD45+CD3+CD4+）的總數(shù)（圖5 C），這是通過流式細(xì)胞儀和CD4的免疫組化染色所得出的結(jié)果（圖5 D）。隨著浸潤的減少，CD4 T細(xì)胞也顯示出細(xì)胞內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子的減少，包括IFN-γ，IL-17，和GM-CSF（圖5 E、F）。因此，在各種臨床前模型中，2DG對糖酵解的抑制可以改善EAE的疾病進(jìn)展，并且能夠減少浸潤性免疫細(xì)胞的數(shù)量和能力。

圖5 | 靶向能量通路調(diào)節(jié)EAE小鼠CD4細(xì)胞浸潤和應(yīng)答

4.2DG對糖酵解的抑制恢復(fù)了EAE中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的代謝程序

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是多發(fā)性硬化癥和EAE中脫髓鞘的主要影響因素，具有高度可塑性。一旦單核細(xì)胞在疾病期間滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，單核細(xì)胞則會(huì)分化為促炎癥或抗炎癥型巨噬細(xì)胞，它們的比例決定了EAE疾病的結(jié)果。作者研究了2DG對免疫后第20天單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤和表型的影響。與未治療的EAE組相比，2DG治療組的巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（圖6 A）。這一觀察也得到了脊髓腰部區(qū)域F4/80的免疫組化染色的支持（圖6 B）。2DG融入細(xì)胞并被己糖激酶磷酸化，導(dǎo)致產(chǎn)生非代謝性的2-脫氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P），從而抑制糖酵解。

為了測試激活的單核細(xì)胞是否在疾病期間吸收2DG，作者在免疫后第20天用單核細(xì)胞分離試劑盒從2DG治療和未治療的EAE組的脾臟中分離出單核細(xì)胞，并估計(jì)2DG6P的含量。2DG治療組的單核細(xì)胞的2DG6P水平明顯較高（圖6 C），表明在治療的動(dòng)物中2DG被單核細(xì)胞吸收。從2DG處理的EAE小鼠中分離出的單核細(xì)胞表現(xiàn)出葡萄糖攝取減少（圖6 D），在培養(yǎng)基中乳酸分泌減少（圖6 E），表明2DG處理抑制糖酵解。

為了進(jìn)一步確定2DG對體內(nèi)巨噬細(xì)胞代謝的影響，在免疫后第20天分離出脾臟巨噬細(xì)胞并進(jìn)行糖酵解測量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組巨噬細(xì)胞中的糖酵解增強(qiáng)并沒有促進(jìn)能量的產(chǎn)生（圖6 G）。經(jīng)處理的小鼠的巨噬細(xì)胞顯示出較高的代謝表型，而經(jīng)2DG處理的巨噬細(xì)胞顯示出較低的代謝狀態(tài)，與健康對照組的巨噬細(xì)胞相似。與未治療組相比，從2DG治療的EAE中分離出的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的糖酵解減少與關(guān)鍵糖酵解酶的表達(dá)有關(guān)（圖6 H）。

從用2DG處理的EAE小鼠中分離出的脾臟巨噬細(xì)胞顯示出M2表型，促炎癥表型減少，導(dǎo)致抗炎性/促炎性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表型的比例提高（圖6 I）。流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察。隨后在免疫后第6天將分離自2DG治療或未經(jīng)治療的EAE組的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到有活動(dòng)性EAE的受體B 6小鼠體內(nèi)。與采用未經(jīng)處理的EAE單核細(xì)胞組相比，采用轉(zhuǎn)移的2DG處理過的單核細(xì)胞明顯改善了EAE的嚴(yán)重程度，并將其轉(zhuǎn)移到接受MOG免疫的B6小鼠體內(nèi)（圖6 K)。這些數(shù)據(jù)表明，2DG對糖酵解的抑制使單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向抗炎表型分化，從而有能力抑制EAE的病程。

圖6 | 2-脫氧葡萄糖通過破壞糖酵解代謝途徑誘導(dǎo)單核細(xì)胞抗炎表型

5.2DG對糖酵解的抑制限制了神經(jīng)炎癥的發(fā)展

為了進(jìn)一步檢查2DG是否在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中積累，作者用LC-MS/MS檢測了EAE組和2DG處理組的脊髓中2DG6P的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與EAE組相比，2DG處理的EAE動(dòng)物脊髓中的2DG6P水平明顯較高（圖7 A），這表明2DG能夠進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部，并可能在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的同時(shí)直接抑制神經(jīng)炎癥。為了確定2DG介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制，測試了2DG處理是否影響MOG刺激的MN細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘發(fā)炎癥的能力。

作者使用體外共培養(yǎng)模型，在有或沒有2DG的情況下，用MOG35-55體外處理脾/淋巴結(jié)單懸液細(xì)胞。72小時(shí)后，來自兩個(gè)處理組（MOG-CM和MOG-2DG-CM）的條件培養(yǎng)基和分離的MN細(xì)胞被用于進(jìn)一步研究（圖7 B）。與MOG-MNs共培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞顯示炎癥介質(zhì)（iNOS）的表達(dá)和一氧化氮的產(chǎn)生增加，而2DG處理的MOG刺激的MNs細(xì)胞不能誘導(dǎo)混合膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS表達(dá)（圖7 B、C）。同樣，MOG刺激的MNs細(xì)胞誘導(dǎo)混合膠質(zhì)細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；然而，2DG處理的MOG刺激的MNs與混合膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)不能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生（圖7 D）。與MOG刺激的MNs混合膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)類似，MOG-CM也能誘導(dǎo)混合腦膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥介質(zhì)（iNOS）和細(xì)胞因子的表達(dá)，而與MOG-CM相比，2DG-CM加入混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中（1:1比例），能抑制iNOS表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生（圖7 E）總的來說，2DG對糖酵解的抑制改變了MN的功能和表型，導(dǎo)致對炎癥和脫髓鞘的保護(hù)。

圖7 | 糖酵解的減少抑制了腦膠質(zhì)細(xì)胞的激活

相關(guān)討論

作者通過代謝組學(xué)確定了正常和復(fù)發(fā)緩解受試者之間明顯的代謝物分離，并確定了四條重要的途徑，糖酵解是這些途徑的中心連接點(diǎn)，這些途徑因患者的疾病而受到影響。一方面，MS患者生物流體中觀察到的代謝物特征可用于未來的生物標(biāo)記物開發(fā)。另一方面，生物信息學(xué)揭示了一種常見的上游可測試代謝途徑，即糖酵解，作者證明可以使用糖酵解抑制劑在MS小鼠模型中成功靶向。2DG介導(dǎo)的糖酵解抑制有力地表明了該策略對EAE疾病進(jìn)展的有益作用。此外，對改變途徑的深入研究可以深入了解該疾病的免疫病理機(jī)制。隨后，作者的研究提供了額外的證據(jù)，通過觀察患者免疫細(xì)胞中的改變的代謝型，支持MS和其他自身免疫疾病中存在代謝重編程，其定義為更高的糖酵解，這意味著有可能選擇性地針對糖酵解途徑進(jìn)行未來的治療干預(yù)。

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本研究通過非靶代謝組學(xué)，確定了RRMS患者的甘油磷脂、檸檬酸鹽循環(huán)、鞘磷脂和丙酮酸鹽代謝這四條代謝途徑發(fā)生顯著改變，糖酵解作為這些途徑的中心連接點(diǎn)與疾病顯著相關(guān)，為RRMS治療提供新的參考。

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