黑膠蟲百科|細(xì)胞間高效預(yù)防和殺滅黑膠蟲污染、支原體等污染手段分享大全?

2023-08-21 17:31

細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本單位，也是咱們生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的實(shí)驗(yàn)材料之一。因此，培養(yǎng)一窩健康生長的細(xì)胞“寶寶”對(duì)咱們科研人員而言，是一門必不可少的入門手藝。

然而參與過的人都懂，這細(xì)胞培養(yǎng)雖是入門手藝，可一點(diǎn)都不簡單吶！分分鐘來個(gè)污染，尤其是微生物污染，輕則自個(gè)兒的細(xì)胞廢棄，重則連累整個(gè)培養(yǎng)箱，甚至培養(yǎng)室！讓人頭疼不已！

那么究竟有哪些微生物會(huì)造成細(xì)胞污染呢？我們又該如何應(yīng)對(duì)？今天筆者就和大家一起總結(jié)一下~

微生物污染分類

一、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染，其污染主要來源于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、實(shí)驗(yàn)人員（實(shí)驗(yàn)服）、實(shí)驗(yàn)用具等，甚至在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加抗菌素（一般為預(yù)防劑量），也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽?/p>

種類：造成細(xì)菌感染最常見的有革蘭氏陽性菌如枯草桿菌、葡萄球菌等；大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌也會(huì)造成細(xì)菌感染。

特點(diǎn)：細(xì)菌污染的培養(yǎng)液通常會(huì)出現(xiàn)渾濁、PH下降，也有少部分會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染情況，建議每天仔細(xì)觀察；被污染的細(xì)胞在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或者崩潰，從壁上脫落死亡。一般細(xì)菌污染進(jìn)程很快，大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到變化。

細(xì)胞房細(xì)菌污染 ①86六⑥四泗97⑨④

二、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的另一種污染，尤其在霉雨季節(jié)，霉菌污染尤為嚴(yán)重。另外由于真菌可以通過孢子繁殖，因此一旦污染很容易發(fā)生擴(kuò)散。

種類：常見的真菌感染有煙曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌污染等。

特點(diǎn)：霉菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)液短期內(nèi)一般不會(huì)渾濁，可在培養(yǎng)液表面形成白色或黃色漂浮物（斑點(diǎn)狀，易于觀察）；高倍鏡下可見明顯的絲狀、管狀或是樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞間；念珠菌和酵母菌污染一般會(huì)成卵圓形散在細(xì)胞周邊，并且酵母菌污染會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁。真菌污染會(huì)與細(xì)胞搶奪營養(yǎng)，還會(huì)釋放次級(jí)代謝物毒害細(xì)胞，造成細(xì)胞活力變差，生長速度變慢，甚至死亡。

細(xì)胞房真菌污染①86六⑥四泗97⑨④

三、支原體污染

支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間，并獨(dú)立生活的原核微生物，廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)。

種類：細(xì)胞培養(yǎng)中常見的支原體有口腔支原體、精氨酸支原體、萊氏無膽甾原體、豬鼻支原體、肺炎支原體和發(fā)酵支原體，其中前四者占據(jù)支原體污染的絕大比例。

特點(diǎn)：支原體大小為0.1-0.3μm，可以輕易通過我們常用于除菌的0.22μm和0.45μm孔徑濾膜；并且在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下無法觀察到，熒光顯微鏡下可用DAPI染色觀察到支原體污染；此外支原體無細(xì)胞壁，可以直接且緊密結(jié)合宿主細(xì)胞細(xì)胞膜，適當(dāng)條件下可能導(dǎo)致細(xì)胞融合。

支原體污染具有隱蔽性，他們可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不渾濁。大部分細(xì)胞被污染后似乎無明顯變化，但其實(shí)支原體會(huì)抑制細(xì)胞生長，并且導(dǎo)致染色體畸變等，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)影響巨大。

細(xì)胞房支原體污染

四、黑膠蟲污染

黑膠蟲是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界至今還有爭議。這里我們暫且將其認(rèn)作是一種微生物。黑膠蟲污染主要來源于血清。

特點(diǎn)：黑膠蟲污染起初對(duì)細(xì)胞并無影響，當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)則會(huì)影響細(xì)胞生長。受黑膠蟲污染的細(xì)胞液通常清亮無變化，在高倍顯微鏡下可以觀察到點(diǎn)狀片狀的游動(dòng)小體，做布朗運(yùn)動(dòng)。

細(xì)胞房黑膠蟲污染

五、病毒污染

病毒作為一種比支原體更小的微生物，體型在nm級(jí)，很難用常規(guī)方法檢測到。病毒污染分為外源性和內(nèi)源性，污染主要來源為細(xì)胞系，常見于雜交瘤細(xì)胞。

特點(diǎn)：病毒污染的細(xì)胞液通常清亮無變化，大部分被污染的細(xì)胞也不會(huì)產(chǎn)生形態(tài)及病理現(xiàn)象，小部分病毒會(huì)造成細(xì)胞變圓、腫脹、脫落。

病毒污染可用血細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)、免疫熒光抗體法以及電子顯微鏡法檢測，但其清除是十分困難的，一旦不幸被污染，建議直接重新引入高質(zhì)量細(xì)胞株。

微生物污染預(yù)防

微生物污染在細(xì)胞培養(yǎng)中是非常常見的，也是令人頭大的一件事情。所以我們一定要將問題扼殺于搖籃之中，規(guī)范實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)步驟，確保細(xì)胞“寶寶”在無污染的情況下健康成長。

1．實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，準(zhǔn)備好所需的試劑和器材。玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒：1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上；2)干烤消毒140℃2小時(shí)以上。

2．培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn)：將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4℃保存。

3．消化液(pH7.8)或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20℃保存。

4．超凈臺(tái)用紫外燈照射30-60min，并開啟超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)5-10min，然后用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面，再開始實(shí)驗(yàn)操作。

5．實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，佩戴好口罩及手套，穿上潔凈實(shí)驗(yàn)服，有長發(fā)則將長發(fā)扎起或者佩戴帽子，避免灰塵或唾液進(jìn)入培養(yǎng)物中。

6．進(jìn)入超凈臺(tái)前應(yīng)用75%酒精對(duì)雙手及手腕進(jìn)行全面擦拭，確保除菌完全。

7．實(shí)驗(yàn)用品用75%酒精擦拭后才能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

8．操作時(shí)小心取用無菌物品，應(yīng)避免污染。勿碰觸吸管尖頭，不小心碰觸后應(yīng)立即更換；手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，容器打開后，傾斜45度操作，操作完成后及時(shí)蓋上瓶蓋。

9．每次操作只處理一種細(xì)胞；即使不同細(xì)胞使用相同的培養(yǎng)基也不要共享同一瓶培養(yǎng)基，避免細(xì)胞間的交叉污染。

10．實(shí)驗(yàn)用品用完應(yīng)移出超凈臺(tái)，以利于空氣流通；實(shí)驗(yàn)完成后用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面。

11．定期清洗或更換超凈臺(tái)過濾膜、預(yù)濾網(wǎng)。

12．此外CO2培養(yǎng)箱的清潔是較易被忽視的地方，應(yīng)1-2個(gè)月對(duì)培養(yǎng)箱定期進(jìn)行清潔消毒。先用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁、隔板、水盤2-3次，用雙蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外燈照射1h以上或進(jìn)行高溫高壓滅菌處理。水盤內(nèi)加入無菌水（應(yīng)每周更換），待培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、濕度、CO2濃度穩(wěn)定后再放入細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染去除方案

有同學(xué)可能會(huì)問，細(xì)胞已經(jīng)被污染了怎么辦？還能挽救嗎？

首先我們要知道，在任何情況下，完全去除細(xì)胞中的微生物污染是非常困難的！因?yàn)椴还苁悄囊环N操作，對(duì)細(xì)胞的生長而言都是一種額外刺激，很有可能導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)改變甚至死亡；而過度使用抗生素可能產(chǎn)生更強(qiáng)抗性的菌株，撤藥后極易復(fù)發(fā)。

所以，對(duì)于易于重新獲得的細(xì)胞株，我們建議直接處理培養(yǎng)物，不分?jǐn)澄胰肯麥纾乐垢腥緮U(kuò)散！對(duì)于極為珍貴的細(xì)胞樣本，我們可以嘗試以下處理方法進(jìn)行挽救。

筆者在多年的實(shí)踐過程中接觸到不少細(xì)胞培養(yǎng)污染問題，這里提供一款全新的細(xì)胞房支原體污染清除方案，供大家參考。潤聯(lián)很多成功案例顯示：解決細(xì)胞間支原體污染，可以使用諾福支原體清除劑 + 比林科漢干霧過氧化氫滅菌設(shè)備。

面對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室苛刻的設(shè)備損耗條件，比林科漢具備過氧化氫消毒機(jī)優(yōu)秀的材料兼容性。對(duì)玻璃、不銹鋼、環(huán)氧樹脂等實(shí)驗(yàn)室常見材料腐蝕性小，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室清潔消毒的更好選擇！

專業(yè)解決細(xì)胞間支原體污染、真菌污染問題、噬菌體污染問題、黑膠蟲污染問題，治理經(jīng)驗(yàn)豐富，可提供上門消毒服務(wù)和指導(dǎo)，包括上海細(xì)胞房上門消毒服務(wù)、蘇杭、北上廣深等地