研究結果

1. 一種新 tRNA-Asp-AUC 的細菌結構、功能和基因組信息

對 SPC6 的 tRNA 補體的分析揭示了編碼 44 個不同物種的 75 個 tRNA 基因。該補體包括一個可能的具有反密碼子序列 AUC 的 tRNA-Asp。該 tRNA-Asp-AUC 的 Cove 評分（二級結構穩(wěn)定性和因此功能的預測因子）為 29.08，反密碼子環(huán)的莖由 3 個 G:C 堿基對穩(wěn)定（圖1A）。在3tRNA 數(shù)據(jù)庫、GtRNAdb、tRNADB-CE和 tRNAdb 數(shù)據(jù)庫進行搜索，僅在五個細菌基因組中揭示了潛在的 tRNA-Asp-AUC，這些潛在 tRNA 物種的功能沒有被分析，并且它們與 SPC6 tRNA-Asp-AUC 沒有顯著同源性。

作者還用6個GAT密碼子在天藍色鏈球菌菌株中表達修飾的 eGFP 基因，該菌株也表達 tRNA-Asp-AUC，其天然啟動子整合到染色體中。在該菌株中觀察到熒光營養(yǎng)菌絲，表明 eGFP mRNA 在早期生長階段的有效翻譯（圖1D），結果證實了在沒有同源 tRNA 的情況下，依賴于擺動堿基配對的 GAU 密碼子的翻譯在營養(yǎng)生長期間效率低下。這些實驗證實了預測的 tRNA-Asp-AUC 確實有效地解碼了 GAT 密碼子。

圖1 | tRNA-Asp-AUC的結構和功能分析

2.tRNA-Asp-AUC 影響異源模型鏈霉菌、天藍色鏈霉菌中的基因表達

作者預測 tRNA-Asp-AUC 的表達可以導致由帶有 GAT 密碼子的基因編碼的蛋白質更有效地翻譯。事實上，在營養(yǎng)瓊脂上生長后，在 3 天和 5 天兩個時間點，將有和沒有 tRNA 的天藍色鏈霉菌菌株的iTRAQ蛋白質組學結果進行比較，具有顯著差異。例如，在第 3 天過表達的蛋白質中，有幾個是具有一個或多個 GAT 密碼子的轉錄調節(jié)因子（例如 SCO2015、SCO223、SCO2517、SCO4628、SCO4677、SCO6286 和 SCO7146）。值得注意的是，就生物學功能而言，它們是由兩種抗生素 BGC 編碼的蛋白質。

生長條件可能會影響發(fā)育表型和抗生素生產(chǎn)，因此為了研究生長條件如何影響由于新型 tRNA 的活性而過表達的蛋白質組，分析了在基本培養(yǎng)基上生長3天后的培養(yǎng)物的蛋白質組。在這些條件下，209 種和tRNA相關蛋白質上調，其中只有27種與在營養(yǎng)瓊脂上生長3天后觀察到的常見上調蛋白質一致。此外209 個基因中GAT密碼子的平均頻率較低，為每個堿基對 0.0007，表明 tRNA 對基因表達的直接影響較小。

此外6種參與十一烷基普羅地寧生物合成的蛋白質被過表達。各自的基因（redR、redP、redO、redN、redL和 redK）是屬于十一烷基脯氨酸BGC的兩個操縱子的組成部分。當培養(yǎng)物在營養(yǎng)瓊脂上生長時，其中兩個基因 redR和redL 由于tRNA而過度表達。

3.新型tRNA促進天藍色鏈球菌的早熟生產(chǎn)抗生素

基于iTRAQ蛋白質組學分析結果，作者認為表達 tRNA-Asp-AUC 的天藍色鏈球菌中十一烷基普羅地寧的合成會增加。在培養(yǎng)基瓊脂上生長 10 天后，與對照菌株相比，該菌株明顯產(chǎn)生了更多的紅色抗生素（圖 2A），但在很大程度上缺乏氣生菌絲和孢子鏈的發(fā)育。當這種突變的 tRNA 在天藍色鏈球菌中表達時，產(chǎn)生的十一烷基普羅地寧要少得多（圖 2A），并且氣生菌絲的發(fā)育在很大程度上得到了恢復。

為了定量研究 tRNA 對抗生素生物合成的總體影響，在兩種不同生長培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)了兩種天藍色鏈球菌菌株（有和沒有 tRNA-Asp-AUC），并定量分析了產(chǎn)生的三種不同抗生素：放線菌素、十一烷基脯氨酸和鈣依賴性脂肽抗生素 (CDA)。

由于 tRNA 的表達，在兩種培養(yǎng)基的生長過程中，放線菌素和十一烷基脯氨酸的早熟生都被觀察到（圖2C和D）。CDA 的檢測結果還表明，在兩種培養(yǎng)基類型的生長過程中，這種抗生素的大量合成也取決于tRNA的表達（圖2B）。另外在營養(yǎng)瓊脂和基本培養(yǎng)基上生長 5 天后，由于 tRNA，另外一種抗生素——腔霉素也大量產(chǎn)生（圖2E）。

圖2 | 表達 tRNA-Asp-AUC 的天藍色鏈球菌增強抗生素產(chǎn)量

4.不同菌種表達tRNA 可提高重要醫(yī)用抗生素的產(chǎn)量

為了評估tRNA的表達是否可以作為提高抗生素產(chǎn)量的通用手段，將該基因轉移到4個不同的菌種中，它們缺少tRNA并產(chǎn)生用于醫(yī)學的抗生素：S. chattanoogensis，S. filamentosus（也稱為 S.roseosporus），S. clavuligerus，和 S. peucetius。作者比較了含有空載體和克隆的tRNA基因的相應菌株之間的抗生素產(chǎn)量，每種抗生素的產(chǎn)量均依賴于tRNA表達增加而增加（圖3）。

iTRAQ蛋白質組學分析表明 tRNA 可導致天藍色鏈球菌中鈷胺素生物合成基因的過表達。鈷胺素是合成一種甲基供體底物S-腺苷-I-甲硫氨酸 (SAM) 所必需的前體，并與多種抗生素（包括十一烷基脯氨酸、脂肽 CDA 和達托霉素和柔紅霉素）的合成有關。SAM 還可以間接激活放線菌素的生物合成。因此本研究中五種不同鏈霉菌屬中的鈷胺素含量測試結果表明，表達tRNA的菌株產(chǎn)生的鈷胺素產(chǎn)量均顯著增加（圖 4）。

圖3 |? tRNA-Asp-AUC 的表達增強了商業(yè)抗生素的生物合成

圖4 | tRNA-Asp-AUC 的表達增強了鈷胺素的生物合成

相關討論

本研究中作者確定了一種存在于0.7%的NCBI鏈霉菌序列文庫中的 tRNA-Asp-AUC。在其他細菌屬中沒有發(fā)現(xiàn)這種tRNA，實際上只有五種其他細菌物種被預測具有非同源編碼的tRNA-Asp-AUC。作者的研究表明了一種新的范式，即翻譯效率依賴于非規(guī)范堿基配對，涉及更頻繁的GAT密碼子，比TTA 密碼子豐富48倍，在調節(jié)基因表達和影響抗生素生產(chǎn)方面也很重要。S. coelicolor 的iTRAQ蛋白質組學分析揭示了一系列具有不同功能的蛋白質，其過表達依賴于新型 tRNA，包括抗生素生物合成基因。與基因組平均值相比，并非所有基因的 GAT 密碼子頻率都增加，這表明依賴于 tRNA 的翻譯和基因表達之間可能是間接關系。分析結果表明，與基因組平均值相比，抗生素生物合成的多效性和通路特異性調節(jié)基因都含有更高的GAT密碼子含量。

當菌株在不同的生長培養(yǎng)基上生長時，在S. coelicolor M145中表達tRNA會導致四種不同抗生素的早熟合成。十一烷基普羅地寧和腔霉素合成的增加與iTRAQ蛋白質組學分析中檢測到的幾種生物合成酶的表達增加相關。tRNA還促進了測試的其他物種的抗生素合成增加，可不部分第通過通路特異性和多效性調節(jié)基因的表達增加和輔助因子的合成增加來合理解釋。SAM來源于鈷胺素，是參與抗生素生物合成的重要輔助因子，依賴 tRNA 的鈷胺素合成顯著增加會影響抗生素產(chǎn)量。

研究結論

本文鑒定并證明了一種新型細菌 tRNA 的功能。這種 tRNA 的表達否定了依賴于鏈霉菌中擺動堿基配對的低效率翻譯的要求，從而導致本研究檢測到的所有抗生素產(chǎn)量增加，并為基因表達和抗生素生物合成的調節(jié)建立了新的范例。數(shù)據(jù)表明以這種方式控制鏈霉菌中的翻譯效率不僅可以提高已知抗生素的產(chǎn)量，而且還可以提高天藍色鏈霉菌另外一種抗生素的表達。這是一種合理且相對簡單的通用策略，可以提高翻譯效率的多效性，可以納入未來抗生素的發(fā)現(xiàn)計劃。

小鹿推薦

本文聚焦于一種新型tRNA的結構、功能、表達和對提高鏈霉抗生素代謝物的效果。作者在基因測序的基礎上揭示了一種基于 GAT 密碼子翻譯效率的基因表達調控新方式，并且充分運用iTRAQ蛋白質組學，驗證了tRNA-Asp-AUC的表達對一些抗生素合成關鍵蛋白質表達的正向影響，也間接證實了新型tRNA對提高抗生素產(chǎn)量的效果。這個發(fā)現(xiàn)為抗生素的生產(chǎn)、發(fā)現(xiàn)提供新的視角，也為運用iTRAQ蛋白質組學技術在該方面的研究思路提供新的范例。

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