酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)，是將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過酶作用于底物后的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。一般用酶標(biāo)測定儀測定吸光度（OD值）來反映抗原或抗體含量，靈敏度可達(dá)每毫升納克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

文末有整理ELISA實(shí)驗(yàn)操作的全套視頻，有需要可以自行下載！

常用的ELISA方法

目前常用的ELISA方法有直接法、間接法、雙抗夾心法、競爭法ELISA。

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#01直接法

將抗原固定于ELISA班上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。

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相較于其他類型的ELISA實(shí)驗(yàn)，直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果不容易出錯，

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但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與ELISA版結(jié)合，實(shí)驗(yàn)背景會比較高，而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大，降低了測定的靈敏度。

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#02 間接法

將抗原固定于ELISA班上，隨后分兩步進(jìn)行檢測：首先加入檢測抗體于抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。

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于直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì)，間接ELISA還提供了更大的靈活性，

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缺點(diǎn)：存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合），可能會增加背景，同時與直接ELISA相比，間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟，實(shí)驗(yàn)周期延長。

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03# 夾心法

被檢測的抗原包被再兩個抗體之間其中一個抗體將抗原固定于載體上，即捕捉抗體，另一個則是檢測抗體，此抗體可用酶標(biāo)記后直接測定抗原的量，或不標(biāo)記，再透過酶標(biāo)記的二級抗體來測定抗原的量，這兩種抗體必須小心選取，才可以避免交互反應(yīng)貨競爭相同額抗原結(jié)合部位。

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04# 競爭法

預(yù)先將抗原包被再固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體，實(shí)驗(yàn)是，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原于預(yù)先包被再固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體，如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被再固相載體上的抗原，通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色，需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比

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競爭ELISA相對以上的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式，其主要有點(diǎn)在于可檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。

在測定蛋白質(zhì)等大分子時常用雙抗夾心ELISA方法，在敏感性基因特異性上有明顯的優(yōu)勢。

雙抗夾心法ELISA

#01 原理

雙抗體夾心法是檢測大分子抗原最常用的方法。雙抗夾心法ELISA是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢樣本中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體—抗原—固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。

#02 樣本準(zhǔn)備

A. 血清

全血標(biāo)本自然凝集30min后1000×g離心15min，取澄清，即可檢測。澄清可存放于-20℃，避免反復(fù)凍融。

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B. 血漿

可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30min內(nèi)于2-8℃1000×g 離心15min，或?qū)?biāo)本放于-20℃，避免反復(fù)凍融。（注意：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測）

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C. 細(xì)胞上清

收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清，-20℃存放，避免反復(fù)凍融。

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D.細(xì)胞裂解樣本

①收集細(xì)胞后，用預(yù)冷的10mM PBS洗3次，5000×g離心5min。

②細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心棄上清；

③加PMSF至細(xì)胞裂解液中，終濃度為1mM；

④按每1×107個細(xì)胞，加入1ml細(xì)胞裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，其間上下顛倒使裂解更充分，超聲波破碎處理；

⑤ 4℃，10000×g離心10min；

⑥檢測細(xì)胞裂解樣本總蛋白濃度；

⑦整個過程需在冰上操作，防止蛋白降解。

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E. 組織裂解樣本

①加PMSF至細(xì)胞裂解液中，終濃度為1mM；

②預(yù)先將待檢組織用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg組織加1mL裂解液，用研磨器進(jìn)行研磨，得到的勻漿液可利用超聲破碎處理；

③4℃，10000×g離心10min，取上清，-80℃存放；

④檢測組織裂解樣本總蛋白濃度；

⑤整個過程需在冰上操作，防止蛋白降解。

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#03 實(shí)驗(yàn)操作流程

1.標(biāo)準(zhǔn)品和樣本制備

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2.酶標(biāo)板拆分

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3.標(biāo)準(zhǔn)品和樣本點(diǎn)樣

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4.生物素抗體制備

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5.洗液配制

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6.濃縮HRP酶結(jié)合物工作液配制

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7.顯色

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8.終止反應(yīng)

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9.上機(jī)與數(shù)據(jù)分析

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如何選擇ELISA試劑盒？

1.特異性：ELISA試劑盒的特異性于試劑盒的關(guān)鍵組分，抗體對有關(guān)，若抗體對中之一為多抗，另一個必須為單抗，建議使用雙單抗，

2、靈敏度：靈敏度反映的是試劑盒檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力，用戶可根據(jù)自己樣本中待檢指標(biāo)的量選擇合適的試劑盒，如果待檢指標(biāo)量很低，一般的試劑盒不能滿足要求，可選擇高敏的ELISA試劑盒。

3、重復(fù)性：科學(xué)實(shí)驗(yàn)講求重復(fù)性，一般ELISA試劑盒，期板內(nèi)和板間變異系數(shù)應(yīng)該控制在15%以內(nèi)。

4、簡便性：試劑盒在保證高質(zhì)量數(shù)據(jù)的情況下，實(shí)驗(yàn)時間越短，操作越便利，越容易受到用戶歡迎，

ELISA 試劑盒常見問題解析

10條ELISA 實(shí)驗(yàn)通用技巧

1.? 室溫

確保所有試劑在使用前均平衡至室溫（除非另有說明）。

2. 防潮

如果有剩余檢測孔，則將剩余的孔板密封保存，以防止有效成分降解。

3. 分裝

對于非一次性使用的標(biāo)準(zhǔn)品，將剩余標(biāo)準(zhǔn)品等分至較小體積并冷凍保存，以防止反復(fù)凍融。

4. 使用多道移液器

多道移液器可以加快標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的鋪板速度，并得到更一致的結(jié)果。

5. 加樣角度

加樣時，將移液器槍頭保持一定傾斜角度，不要接觸微孔底部。

6. 更換移液器槍頭

建議在不同樣品或標(biāo)準(zhǔn)品之間更換移液器槍頭，以防止污染。

7. 盡量使用洗板機(jī)

因?yàn)槭褂枚嗟酪埔浩魇謩酉窗蹇赡軐?dǎo)致更高的背景，因此建議使用洗板機(jī)。

8. 增加浸潤時間

在手動或用洗板機(jī)清洗微孔板時，在兩次洗板步驟之間增加 30 秒的浸潤時間，便于洗滌緩沖液發(fā)揮功效。

9. 孵育時間

密切關(guān)注孵育時間，每小時孵育時間的誤差應(yīng)控制在 5 min 內(nèi)。

10. 多板操作，切勿疊放

如果正在進(jìn)行多板操作，請勿在孵育期間將微孔板堆疊在一起，而應(yīng)單獨(dú)放置在平坦表面上。

ELISA與IHC、WB的區(qū)別

ELISA實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)資料匯總