問題說明：正向測序失敗，反向成功，但是比對后發(fā)現(xiàn)存在后面目的片段不全，以及部分位點的突變。峰圖也存在突變位點信號不足的問題。

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解決方案1：首先打電話和技術溝通

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給出了專業(yè)的回答：結果可以與您預期序列比對上的話，是代表插入成功的~反向成功的結果整體信號也非常弱，正向的失敗，從膠圖來看很有可能是模板濃度較低導致的，建議您可以送菌液測序。

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解決方案2：咨詢實驗室同門的話，可以知道，峰圖和測序結果前后100bp結果是不準確的，需要進行載體通用引物的測序，不建議使用質粒上的外源插入目的片段的引物測序。

因此我和技術溝通后進行了測序引物的更換，加測了通用引物的測序。等待結果中，如果后續(xù)結果不好的話，還需要進行菌液送測。

解決方案3：看下知乎大神的解決方案

1.樣品測序無信號

可能是引物結合位點不存在或被破壞；建議更換引物測序或重新提供樣品測序。

2.樣品測序信號差

可能是引物或模板的質量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的，也可能是樣品濃度偏低；建議提供高質量樣品測序。

3.樣品測序衰減

可能是由于特殊結構如Poly結構、重復序列、回文結構、發(fā)卡結構、GCrich、AT富集等導致的測序衰減，由于是樣品本身結構問題無法優(yōu)化建議反向測序進行拼接以得到完整序列，還有一種衰減的情況就是在一段正常峰型后逐漸衰減，可能是模板量反應量不足導致，建議制備高濃度模板測序。

4.樣品測序套峰

套峰細分的話有如下幾種情形:

①全雙峰：多引物結合位點（針對菌液、質粒樣品），非特異性擴增（針對PCR產(chǎn)物）；

②前雙峰：多引物結合位點，其中一套模板測序中斷（針對菌液、質粒樣品），多引物結合位點（PCR未純化樣品），引物二聚體或小片段干擾（針對PCR已純化樣品）；

③中間雙峰：非單克?。ㄡ槍|粒、菌液樣品），堿基缺失或等位基因雙模板（針對PCR未純化樣品）；

④后雙峰：非單克?。ㄡ槍?、質粒樣品），堿基缺失（針對PCR樣品）；

針對二聚體及小片段干擾的情況建議電泳切膠回收純化；針對多引物結合位點的情況建議更換引物測序或反方向測通樣品；針對堿基缺失建議克隆測序；針對非單克隆建議在克隆無誤的前提下重新挑取單克隆測序；針對非特異性擴增建議優(yōu)化反應條件重新制備樣品測序；針對等位基因雙模板建議克隆測序。

5.樣品測序中斷

可能樣品存在特殊高級結構，導致dNTP和ddNTP在某一堿基位點后無法與模板結合，測序酶無法繼續(xù)延伸，建議使用反向引物進行測序經(jīng)拼接后可以得到完整序列；或酶切后亞克隆測序。6.樣品測序移碼

測序從開端發(fā)生移碼可能是引物發(fā)生降解，建議重新提供引物；測序局部出現(xiàn)移碼，可能樣品存在特殊高級結構，建議反向測通。

7.樣品測序底峰干擾

可能測序引物不純，建議將引物進行PAGE膠純化后在進行測序或重新提供引物測序；可能測序樣品不純，混有正、反向引物，建議重新制備樣品測序。