MOL THER-NUCL ACIDS最新報道：亨廷頓病治療新進展
本文由brainnews腦科學世界團隊原創(chuàng)編譯，轉(zhuǎn)載請聯(lián)系授權(quán)。
近期，發(fā)表在Molecular Therapy-Nucleic Acids上題為“A CAG repeat-targeting artificial miRNA lowers the mutant huntingtin level in the YAC128 model of Huntington’s disease”的文章，通過在紋狀體內(nèi)注射AAV5載體，將shRNA和amiRNA的CAG重復序列導入YAC128小鼠大腦中，發(fā)現(xiàn)shRNA和amiRNA均使突變亨廷頓蛋白水平降低，而不影響內(nèi)源性亨廷頓蛋白。此外，注射amiRNA治療小鼠使脾臟重量降至健康小鼠的特征值，并改善靜態(tài)棒試驗的運動性能。
1、人工靶向miRNA的CAG重復序列的設(shè)計與特性
在HD患者來源的細胞系中檢測到amiR136-A2，該細胞系在突變的HTT等位基因中有較短的CAG重復區(qū)。研究人員通過使用兩種抗HTT抗體，證明amiR136-A2可顯著降低突變HTT蛋白水平。再以含有16、40和57個CAG重復序列的HTT外顯子1為靶點，通過熒光素酶分析amiR136-A2的等位基因選擇潛力，觀察到amiR136-A2的重復長度依賴性沉默。
其中有40個CAG重復序列的靶序列，HTT沉默效率約為50%，而有16個CAG重復序列的正常HTT變體的表達減少約20%，這證實了amiR136-A2的等位基因偏好(圖1)。
圖1：不同amiRNAs的效率和等位基因選擇性
2、ShA2和amiR136-A2以等位基因選擇性方式降低體內(nèi)突變HTT水平
將表達shA2或amiR136-A2的AAV5載體分別單側(cè)注射到小鼠的紋狀體中。注射后一個月，處死小鼠，并處理其大腦。研究人員使用H1或CAG啟動子特異性引物進行RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)注射小鼠中的載體DNA水平與HTT蛋白的沉默效率相關(guān)。
與SCR對照組相比，表現(xiàn)出最強載體轉(zhuǎn)導的小鼠的HTT蛋白水平下降幅度最大，但內(nèi)源性mHTT水平?jīng)]顯著降低。在一些動物中觀察到海馬和皮層的HTT沉默程度高于紋狀體，這可部分解釋為AAV5-GFP在周圍區(qū)域的廣泛不均勻分布(圖2)。
圖2：AAV5-GFP在YAC128小鼠腦內(nèi)的分布以及CAG靶向RNAi觸發(fā)器在體內(nèi)的效率和等位基因選擇性
3、接受shA2與amiR136-A2治療的小鼠的長期療效比較
成年小鼠接受雙側(cè)紋狀體內(nèi)注射低、高劑量攜帶shA2或amiR136-A2的AAV5。注射后每5周，評估小鼠體重，并進行行為測試。注射后20周，處死小鼠，取出大腦、心臟和脾臟，稱重并快速冷凍以進行分析。
經(jīng)過Western印跡分析發(fā)現(xiàn)，與SCR對照組相比，不管低劑量或高劑量的shA2和amiR136-A2治療，這兩分子都以等位基因選擇性的方式沉默HTT的表達。研究人員再對HTT轉(zhuǎn)錄水平的分析未顯示對照組和amiR136-A2治療組動物之間的任何差異，證實了翻譯抑制作用機制(圖3)。
圖3：紋狀體內(nèi)注射A2 shRNA和amiRNA小鼠20周后HTT蛋白和mRNA水平分析
另外，YAC128小鼠表現(xiàn)出年齡依賴性神經(jīng)病理學，表現(xiàn)為全腦萎縮，包括紋狀體丟失和HTT聚集，而amiR136-A2處理的小鼠紋狀體中polyQ聚集體數(shù)量呈劑量依賴性減少(圖4)。
圖4：注射amiR136-A2 20周后HTT聚集物數(shù)量減少
4、注射amiR136-A2 20周后，小鼠表現(xiàn)耐受性良好
與其他組的小鼠相比，注射低劑量shA2的小鼠體重較輕，且體重不會隨時間增加。在實驗結(jié)束后，對心臟、大腦和脾臟進行稱重，發(fā)現(xiàn)amiR136-SCR對照組和amiR136-A2治療組動物的器官重量僅在脾臟存在顯著差異，未觀察到注射腦區(qū)的組織病理學變化。
研究人員選擇與A2 siRNA完全互補的轉(zhuǎn)錄本(Golga4、Soga3、Maml1、Ccdc177、Th和Ppp1r3f)，發(fā)現(xiàn)高劑量amiR136-A2只能下調(diào)六個受試轉(zhuǎn)錄本中的一個(Golga4)，但下調(diào)在統(tǒng)計上并不顯著(圖5)。
圖5：紋狀體內(nèi)注射amiR136-A2后缺乏明顯的脫靶效應(yīng)
5、ShA2和amiR136-A2可改善某些運動和認知缺陷
研究人員對小鼠進行加速rotarod試驗去評估運動缺陷的改善情況和學習能力時，發(fā)現(xiàn)接受高劑量shA2治療的小鼠表現(xiàn)優(yōu)于接受對照shSCR治療的小鼠，但在術(shù)后15周時，低劑量shA2治療顯著影響YAC128小鼠的學習能力。
此外，通過靜態(tài)棒試驗評估小鼠的運動能力時發(fā)現(xiàn)，在治療15周后，用shA2和amiR136-A2治療的小鼠都比WT小鼠更快穿過17 mm桿。而且與shSCR對照組相比，都表現(xiàn)出顯著的性能差異。
6、總結(jié)
目前，降低HTT水平的治療策略在減少HD病理方面有良好前景和臨床意義。使用非選擇性amiRNA和AAV5載體的最先進的基于RNAi的方法正在進行I期/IIa臨床試驗，這為治療其他polyQ疾病提供額外的等位基因選擇性。
總而言之，該CAG靶向策略和amiRNA可為HD治療方法做出獨創(chuàng)性和有價值的貢獻。
編譯作者：brainnews創(chuàng)作團隊
