單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）開創(chuàng)了以細(xì)胞為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組分析的新時代。毫不夸張地說，scRNA-seq 的出現(xiàn)正在徹底改變從組織到細(xì)胞的整個轉(zhuǎn)錄組的細(xì)節(jié)。有了這項顛覆性的技術(shù)，現(xiàn)在可以前所未有地挖掘組織類型之間和細(xì)胞內(nèi)的異質(zhì)性。這使得能夠更快速地識別稀有和發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型，同時表征多種不同的細(xì)胞類型和狀態(tài)，更準(zhǔn)確、更完整地了解它們在生命過程中的作用。單細(xì)胞測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中已有廣泛應(yīng)用，并逐漸在動植物研究中展開應(yīng)用。越來越多從事植物研究的科研工作者已經(jīng)利用單細(xì)胞/空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)進(jìn)行組織異質(zhì)性、發(fā)育、抗逆、以及育種等方面的研究，解決了眾多動植物領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。然而，在植物方向的單細(xì)胞組學(xué)應(yīng)用上依然存在一些難題，接下來我們一起來了解一下~

難點一：原生質(zhì)體的制備無法形成通用的原生質(zhì)體制備方法

對于植物來說，單細(xì)胞實驗在收集細(xì)胞之前，需要通過酶消化去除細(xì)胞壁（原生質(zhì)體制備）。而植物原生質(zhì)體制備存在以下幾個難點：

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植物細(xì)胞被固定在剛性細(xì)胞壁基質(zhì)中，分離單細(xì)胞時需要將其去除；

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植物細(xì)胞壁的酶消化是一種重要的脅迫源，容易刺激植物細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)壓力應(yīng)答基因的表達(dá)，人為引入轉(zhuǎn)錄偏差；

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植物原生質(zhì)體大小存在可變性（滲透壓導(dǎo)致的原生質(zhì)體脹大，甚至破裂影響后續(xù)實驗）；

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質(zhì)體細(xì)胞器和液泡中存在可與 RNA 相互作用的次級代謝物導(dǎo)致表達(dá)量檢測不準(zhǔn)確；

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不同組織類型間適用的酶組合不同，需要優(yōu)化消化細(xì)胞壁所需的酶；

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制備的原生質(zhì)體很脆弱，活性波動大。

難點二：部分物種已知 Maker 基因較少不能準(zhǔn)確鑒定細(xì)胞類型

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沒有任何的研究基礎(chǔ)的物種，可以根據(jù)切片顯微鏡觀察橫斷面結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞注釋（Wang Q et al., 2022）；

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有少量研究基礎(chǔ)，這種情況可以做切片來進(jìn)一步觀察組織結(jié)構(gòu)，利用這個結(jié)果不僅可以驗證前人的研究結(jié)果，還可以有新發(fā)現(xiàn)；或者將前人的研究基礎(chǔ)和研究目的結(jié)合，只注釋感興趣和后續(xù)研究的細(xì)胞類型；

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研究基礎(chǔ)比較多的情況，這種可以 Marker 基因來進(jìn)行注釋，同時也可利用與特定組織部位的 bulk 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對從而對單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分群鑒定。

難點三：部分物種無參考基因組

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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析時需要將 reads 比對到參考基因組，然后再使用定量軟件進(jìn)行定量，無參考基因組則無法完成基因定性定量；

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其次，在進(jìn)行注釋時也需要根據(jù)基因表達(dá)情況輔助進(jìn)行；無參考基因組也會為注釋工作帶來一定限制。

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目前，博奧晶典已積累豐富的項目經(jīng)驗，針對不同物種的多種組織類型開發(fā)了特有的解離方法，已成功完成了擬南芥、水稻、煙草、荊芥、油菜、白菜、橄欖、苜蓿、蘋果、梨、菠菜等多物種多部位的原生質(zhì)體制備。其次，對于比較難制備原生質(zhì)體的物種博奧晶典推出植物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來解決此難題，它的出現(xiàn)為植物單細(xì)胞研究提供了更多可能。
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細(xì)胞注釋方面，博奧晶典自主搭建了?SingleCellBase?細(xì)胞注釋數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合 2000+?篇高分單細(xì)胞文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，納入了多個物種（包括魚、雞、猴子、豬、擬南芥等 33 個物種）和組織的細(xì)胞類型 Markers，實現(xiàn)了各類物種各類組織的細(xì)胞類型精準(zhǔn)注釋。

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對于無參考基因組的物種有以下幾種解決方案：1、組裝一個基因組再進(jìn)行后學(xué)分析，但這種方式難度較大、成本較高，而且時間較長；2、使用三代全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)構(gòu)建參考轉(zhuǎn)錄本，然后直接將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與參考轉(zhuǎn)錄本比對。

植物單細(xì)胞測序的應(yīng)用潛力不言而喻，那植物單細(xì)胞測序到底能解決哪些科學(xué)問題呢？

構(gòu)建細(xì)胞圖譜及鑒定稀有細(xì)胞

構(gòu)建細(xì)胞動態(tài)發(fā)育軌跡

研究不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

探索脅迫對不同細(xì)胞類型的響應(yīng)

支持發(fā)表案例分享

案例1：Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula

【發(fā)表期刊】Molecular Plant

【發(fā)表時間】2022年

【研究方向】苜蓿根瘤圖譜繪制

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王濤教授、董江麗教授團(tuán)隊在?Molecular Plant?上發(fā)表了苜蓿根瘤的研究論文。該團(tuán)隊攻克了分離根瘤單細(xì)胞的技術(shù)難關(guān)，報道了以截形苜蓿為代表的不定型根瘤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了成熟的不定型根瘤中不同轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式的細(xì)胞類群，以及共生細(xì)胞類型和非共生細(xì)胞類型的分化軌跡和生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)了共生固氮新機(jī)制：固氮細(xì)胞將氮同化為谷氨酰胺，非固氮細(xì)胞將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為天冬酰胺供植物生長發(fā)育的新機(jī)制。

案例2：Single-cell transcriptome reveals differentiation between adaxial and abaxial mesophyll cells in Brassica rapa

【發(fā)表期刊】Plant Biotechnology Journal?

【發(fā)表時間】2022年

【研究方向】大白菜腹面和背面葉肉細(xì)胞的分化

2022年9月,?Plant Biotechnology Journal?在線發(fā)表了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜分子設(shè)計育種團(tuán)隊關(guān)于大白菜背腹面葉肉細(xì)胞的分化的論文。該研究通過對白菜葉片進(jìn)行單細(xì)胞測序結(jié)合改良的 tape-sandwich 方法以及 RNA 原位雜交，區(qū)分了葉片柵欄組織和海綿組織，并鑒定了它們在單細(xì)胞水平的差異，揭示了腹面葉肉細(xì)胞和背面葉肉細(xì)胞的分化是大白菜葉球形成機(jī)制研究的一個重要進(jìn)展。

截止2023年5月，博奧晶典已助力研究人員發(fā)表 5 篇植物領(lǐng)域新成果，影響因子超 63 分。

2023年5月12日，博奧晶典邀請以上兩篇文章的通訊作者齊聚北京，共同參加“博奧晶典首屆動植物單細(xì)胞時空技術(shù)高端應(yīng)用研討會”探討動植物領(lǐng)域的最新應(yīng)用與進(jìn)展。下面跟隨小編的腳步再回顧一下會議的精彩瞬間。

大會精彩回顧

5月12日由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司主辦的“博奧晶典首屆動植物單細(xì)胞時空技術(shù)高端應(yīng)用研討會”在北京成功舉辦，議邀請 8 位動植物單細(xì)胞領(lǐng)域權(quán)威專家，圍繞細(xì)胞共生與分化、發(fā)育及代謝調(diào)控、抗病抗逆機(jī)制研究等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了分享和深度探討，現(xiàn)場氣氛熱烈?，F(xiàn)場近 200 位動植物領(lǐng)域單細(xì)胞及空間組學(xué)研究學(xué)者、師生親臨現(xiàn)場，座無虛席，共同探討單細(xì)胞時空組學(xué)技術(shù)在動植物領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展。

董教授首先介紹了氮素是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素，生物固氮是自然界生物可用氮的最大天然來源。豆科植物與根瘤菌可以相互作用形成共生根瘤。然而，根瘤細(xì)胞的分化和聯(lián)系在很大程度上仍然是未知的。該團(tuán)隊與博奧晶典共同建立了一個改良的根瘤原生質(zhì)體制備方案，攻克了制備根瘤單細(xì)胞原生質(zhì)體懸液的技術(shù)難關(guān)。通過對蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）接種根瘤菌 14 天生長的根瘤進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，揭示了成熟的不定型根瘤中不同轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式的細(xì)胞類群，以及共生細(xì)胞類型和非共生細(xì)胞類型的擬時序分析和生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)了共生固氮新機(jī)制：固氮細(xì)胞將氮同化為谷氨酰胺，非固氮細(xì)胞將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為天冬酰胺供植物生長。王教授團(tuán)隊的研究結(jié)果為研究根瘤器官形成和共生固氮的機(jī)制提供了重要資源。

王老師首先介紹了使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探索大白菜葉片單細(xì)胞的異質(zhì)性的研究過程，在單細(xì)胞水平探索葉片柵欄組織和海綿組織細(xì)胞之間的分化，并確定其關(guān)鍵的調(diào)控基因，對于揭示白菜類蔬菜作物葉片發(fā)育和葉球形成的機(jī)制是十分重要的。該研究使用蓮座期大白菜的幼葉（n=3）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了白菜蓮座期幼嫩葉片的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜。研究不僅成功區(qū)分了葉肉細(xì)胞中的柵欄細(xì)胞和海綿細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)了柵欄細(xì)胞是光合作用的主要細(xì)胞，海綿細(xì)胞主要是為柵欄細(xì)胞的光合作用提供支撐作用。他們還發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞中背腹性基因表現(xiàn)出互斥的表達(dá)模式，在對白菜葉片維管系統(tǒng)不同細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)的分類的同時解析了維管系統(tǒng)的發(fā)育路徑口。研究表明單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組有助于理解和深入解析重要性狀基因功能。

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參考文獻(xiàn)：

1. Wang Q, Wu Y, Peng A, et al. Single‐cell transcriptome atlas reveals developmental trajectories and a novel metabolic pathway of catechin esters in tea leaves[J].?Plant Biotechnology Journal, 2022, 20(11): 2089-2106.

2. Ye Q, Zhu F, Sun F, et al. Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula[J].?Molecular Plant, 2022, 15(12): 1852-1867.

3. Guo X, Liang J, Lin R, et al. Single-cell transcriptome reveals differentiation between adaxial and abaxial mesophyll cells in Brassica rapa[J].?Plant Biotechnology Journal, 2022, 20(12): 2233-2235.