文獻(xiàn)信息：

• 題目：Genome-Wide Association Transethnic Meta-Analyses Identifies Novel Associations Regulating Coagulation Factor VIII and von Willebrand Factor Plasma Levels

• 雜志：Circulation

• 影響因子：37.8/Q1

• 發(fā)表時(shí)間：2019年1月

研究背景：

因子VIII (Factor VIII,FVIII)及其載體蛋白血管性血友病因子(von Willebrand Factor,VWF)調(diào)節(jié)止血和血栓形成，血漿中這些因子的較高水平與動(dòng)脈和靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而較低水平與出血性疾病有關(guān)，并降低血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)。嚴(yán)重的FVIII和VWF缺乏分別導(dǎo)致出血性疾病血友病A和血管性血友病。雖然目前尚不清楚FVIII和VWF水平是否與血栓性疾病的風(fēng)險(xiǎn)有因果關(guān)系，但一些遺傳和觀察證據(jù)表明，這些蛋白對(duì)血栓性疾病有影響。本研究的目的是通過(guò)擴(kuò)大先前全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association stuidies,GWASs)中發(fā)現(xiàn)樣本的大小和祖先多樣性，以及通過(guò)使用1000個(gè)基因組估算數(shù)據(jù)和納入X染色體變異來(lái)提高基因組的覆蓋率，從而確定影響FVIII和VWF血漿水平的新的遺傳關(guān)聯(lián)。對(duì)于具有全基因組意義的發(fā)現(xiàn)，本文對(duì)候選基因座進(jìn)行了第一次功能表征，以提供額外的關(guān)聯(lián)證據(jù)，并更好地了解這些凝血表型的血漿水平調(diào)節(jié)生物學(xué)。最后，通過(guò)應(yīng)用本文的遺傳發(fā)現(xiàn)作為工具變量，使用孟德?tīng)栯S機(jī)化(Mendelian randomization,MR)分析表征了血漿FVIII和VWF水平對(duì)臨床心血管事件的因果關(guān)系。

研究方法：

由于患者保密協(xié)議和遵守研究參與者的同意，原始數(shù)據(jù)和研究材料不能提供給其他研究人員用于重復(fù)結(jié)果或重復(fù)過(guò)程。分析方法將根據(jù)要求提供，摘要統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)已通過(guò)美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館的國(guó)家生物技術(shù)信息中心基因型和表型數(shù)據(jù)庫(kù)(dbGaP)公開(kāi)提供。

該項(xiàng)目由CHARGE聯(lián)盟(基因組流行病學(xué)心臟與衰老研究隊(duì)列)止血工作組組織。分析了來(lái)自9項(xiàng)FVIII水平研究的32610例個(gè)體和來(lái)自18項(xiàng)VWF水平研究的46354例個(gè)體的低頻和常見(jiàn)(次要等位基因頻率[MAF] >0.01)變異的表型-基因型相關(guān)性。共有20項(xiàng)研究對(duì)其中一項(xiàng)或兩項(xiàng)分析都有貢獻(xiàn)，其中包括歐洲、非洲、東亞和西班牙裔的參與者。參與隊(duì)列的描述和血統(tǒng)組成見(jiàn)在線數(shù)據(jù)補(bǔ)充表1。所有的研究都得到了適當(dāng)?shù)臋C(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有的參與者都為他們自己和他們的未成年子女提供了使用他們DNA的書面知情同意書。

1、基因型收集與質(zhì)量控制：

所有參與者使用Illumina或Affymetrix提供的商業(yè)基因分型平臺(tái)進(jìn)行基因分型。每項(xiàng)研究都進(jìn)行了基因分型質(zhì)量控制檢查，并使用可用的代入方法為每個(gè)參與者代入了1000個(gè)基因組群體第1階段第3版中描述的約3500萬(wàn)個(gè)常染色體和x染色體多態(tài)性變異每個(gè)隊(duì)列的變量呼叫和質(zhì)量控制程序在附錄中詳細(xì)描述。

2、統(tǒng)計(jì)分析：

血漿FVIII或VWF水平(或活動(dòng)水平)高于或低于人群平均水平3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(SDs)的參與者被剔除，接受抗凝治療的個(gè)體也被剔除。在每項(xiàng)研究中分別分析天然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化FVIII活性和VWF抗原水平(百分比或國(guó)際單位每毫升x 100)。使用遺傳加性模型對(duì)輸入的變異劑量和表型水平進(jìn)行研究特異性回歸分析，并使用主成分調(diào)整性別、年齡、研究設(shè)計(jì)變量和種群亞結(jié)構(gòu)。所有分析均按祖先分層，然后進(jìn)行薈萃分析。x染色體變異另外按性別分層，男性受試者的劑量值編碼為0/2。

特定研究結(jié)果集中上傳，并在使用EasyQC軟件包進(jìn)行meta分析之前對(duì)所有個(gè)體研究進(jìn)行質(zhì)量控制β或標(biāo)準(zhǔn)誤差值>5或imputation值<0.3的變異被排除在分析之外。對(duì)所有單核苷酸多態(tài)性(SNPs)計(jì)算的估計(jì)次要等位基因計(jì)數(shù)是等位基因頻率、每個(gè)隊(duì)列樣本總數(shù)和代入質(zhì)量的函數(shù);<10的值被排除在分析之外。根據(jù)1000 Genomes phase 1 version 3參考面板對(duì)等位基因進(jìn)行協(xié)調(diào)，排除重復(fù)snp或與參考不一致的snp。

使用固定效應(yīng)倒方差加權(quán)方法對(duì)每個(gè)祖先群體進(jìn)行meta分析，然后使用相同的方法進(jìn)行跨種族分析跨種族分析作為發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈現(xiàn)，使用特定于祖先的分析來(lái)告知和解釋這些信號(hào)。在P<2.5×10?8時(shí)，認(rèn)為全基因組的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以糾正未包括在初始一代GWASs中的低頻變異，并且僅報(bào)道了至少3個(gè)隊(duì)列中通過(guò)質(zhì)量控制的變異。薈萃分析后，MAF <1%的變異被過(guò)濾掉。計(jì)算每個(gè)發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的基因組控制系數(shù)，并用于校正隱型親緣關(guān)系。最后，將一個(gè)位點(diǎn)定義為距離P值最低的SNP±1 Mb，并選擇P值最低的SNP代表該位點(diǎn)。

3、基因沉默對(duì)候選基因座進(jìn)行功能鑒定：

在沒(méi)有復(fù)制隊(duì)列的情況下，對(duì)候選基因座進(jìn)行了第一次功能表征，以提供額外的關(guān)聯(lián)證據(jù)。對(duì)于每個(gè)全基因組顯著位點(diǎn)，選擇了可能負(fù)責(zé)觀察到的關(guān)聯(lián)的候選基因。選擇基于與每個(gè)區(qū)域中最相關(guān)的snp的接近程度，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于snp在調(diào)節(jié)附近基因的表達(dá)和功能方面的推測(cè)作用的信息，以及調(diào)節(jié)VWF/FVIII的假設(shè)生物學(xué)機(jī)制。這個(gè)選擇過(guò)程為每個(gè)相關(guān)位點(diǎn)確定了1到3個(gè)候選基因。為了篩選功能，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Life Line Cell Technology)鍍?cè)谀z原包被的96孔板上，并用小干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific)，使用轉(zhuǎn)染試劑oligofectamine (Thermo Fisher Scientific)靶向候選基因。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4天，然后將培養(yǎng)基替換為對(duì)照培養(yǎng)基或含有10μmol/L組胺的培養(yǎng)基30分鐘，以刺激炎癥反應(yīng)。采用Fitzgerald Industries公司的抗體，采用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)基中的FVIII和VWF, FVIII的檢測(cè)范圍為0.003 ~ 0.21 IU/mL, VWF的檢測(cè)范圍為0.5 ~ 120 ng/μL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)果以與陰性對(duì)照(轉(zhuǎn)染scramble siRNA)相對(duì)表達(dá)量的平均值±SD表示。

主要結(jié)果：

1、FVIII、VWF和多表型Meta分析

用于FVIII Meta分析的數(shù)據(jù)取自25897名歐洲血統(tǒng)、4500名非洲血統(tǒng)、773名東亞或印度裔亞裔血統(tǒng)和1440名西班牙裔參與者，共計(jì)13887196個(gè)變體通過(guò)了所有篩選，并確定了1431個(gè)在11個(gè)位點(diǎn)達(dá)到全基因組統(tǒng)計(jì)顯著性的變體。VWF的數(shù)據(jù)取自42379名歐洲血統(tǒng)、3700名非洲血統(tǒng)和275名西班牙裔參與者，共計(jì)10537485個(gè)變體通過(guò)所有篩選，并在17個(gè)基因座上鑒定出2453個(gè)全基因組顯著變體（圖1A和1B）。

表1展示了FVIII、VWF和FVIII-VWF組合表型的遺傳發(fā)現(xiàn)結(jié)果?？偣茶b定出23個(gè)獨(dú)特的基因位點(diǎn)，其中13個(gè)是以前未報(bào)道的新關(guān)聯(lián)。在新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)中，7個(gè)與FVIII水平相關(guān)(FCHO2/ TMEM171/TNPO1、HLA、SOX17/RP1、LINC00583/NFIB、RAB5C/KAT2A、RPL3/TAB1/SYNGR1/PDGB、ARSA)， 11個(gè)與VWF水平相關(guān)(PDHB/PXK/ KCTD6、SLC39A8、FCHO2/TMEM171/TNPO1、HLA、GIMAP7/GIMAP4、OR13C5/NIPSNAP、DAB2IP、C2CD4B、RAB5C/KAT2A、RPL3/TAB1/SYNGR1/PDGB和ARSA)。

2、功能分析：

本文抑制了12個(gè)基因座中的21個(gè)基因，以評(píng)估對(duì)體外FVIII和VWF分泌的影響(圖2A和2B)，其中包括接近確定的主要候選基因(表1)。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)或組胺刺激條件下，12個(gè)候選基因位點(diǎn)中有10個(gè)基因位點(diǎn)至少具有1個(gè)改變培養(yǎng)基中VWF水平的基因。

具體而言，在基礎(chǔ)條件下，y抑制PDHB、SLC39A8、TMEM171、TNPO1、HLAC、GIMAP7、NIPSNAP3A、NIPSNAP3B、C2CD4B和SYNGR1增加了VWF的釋放，而抑制ST3GAL4則減少了VWF的分泌。

當(dāng)細(xì)胞受到組胺刺激時(shí)，y抑制TMEM171、TNPO1、HLA-C、SNIPSNAP3A(但不包括SNIPSNAP3B)、C2CD4B、KAT2A和TAB1增加了培養(yǎng)基中的VWF釋放，抑制RAB5C則減少了VWF分泌(表1和圖2A和2B)。對(duì)于僅與FVIII水平相關(guān)的5個(gè)基因(LINC00583、NFIB、SOX17、RP1和TMLHE-F8)的實(shí)驗(yàn)無(wú)法在處理過(guò)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測(cè)到FVIII水平，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不確定。

表2?條件分析后所有相關(guān)獨(dú)立變量的特征

研究結(jié)論：

本文發(fā)現(xiàn)了13個(gè)新的基因位點(diǎn)，它們對(duì)血漿FVIII或VWF水平的有著一定程度的影響。本文的發(fā)現(xiàn)方法包括首次功能驗(yàn)證，為新位點(diǎn)的最佳候選基因提供了相關(guān)信息。最后，MR分析提供了一些證據(jù)，表明FVIII血漿水平與冠心病和靜脈血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，VWF血漿水平與IS的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。總之，本文的工作已經(jīng)確定了新的基因座，調(diào)節(jié)止血和凝血所必需的蛋白質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)可能為治療和預(yù)防策略提供遺傳工具，并可能有助于確定新的生物途徑，通過(guò)這些途徑進(jìn)行干預(yù)，以減少動(dòng)脈和靜脈結(jié)果的負(fù)擔(dān)。

1、創(chuàng)新點(diǎn)：

樣本量相對(duì)較大，并且使用了比以往更密集的樣本來(lái)源，通過(guò)這種方法，可以鑒定出不常見(jiàn)的相關(guān)變異，但是新相關(guān)位點(diǎn)中變異的MAF相對(duì)常見(jiàn)，只有1個(gè)變異的MAF <0.10。研究設(shè)計(jì)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)以罕見(jiàn)變異為標(biāo)志的新關(guān)聯(lián)。增加研究參與者的數(shù)量以增加統(tǒng)計(jì)能力或提高基因分型陣列的輸入質(zhì)量可能有助于識(shí)別與結(jié)果相關(guān)的不常見(jiàn)或罕見(jiàn)變異。

2、局限性：

需要通過(guò)復(fù)制來(lái)驗(yàn)證遺傳關(guān)聯(lián)，特別是那些接近統(tǒng)計(jì)顯著性閾值的關(guān)聯(lián)。為了彌補(bǔ)這一局限性，通過(guò)y抑制候選基因和測(cè)量VWF釋放來(lái)進(jìn)行功能驗(yàn)證，而這項(xiàng)功能性工作也是本研究的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)。

另外，只能測(cè)試VWF表達(dá)的調(diào)節(jié)，而不能測(cè)試巨噬細(xì)胞對(duì)VWF清除的調(diào)節(jié)忽略了需要一種特定的細(xì)胞刺激，這種細(xì)胞刺激不能被組胺刺激所模仿。最后，可能是一些遺傳關(guān)聯(lián)的影響只能通過(guò)過(guò)度表達(dá)而不是基因抑制來(lái)觀察。也嘗試測(cè)量FVIII釋放，但水平太低，因此需要新的模型來(lái)驗(yàn)證候選基因?qū)VIII水平的影響，這是方法的局限性。

所有的功能工作都是在體外完成的，這與體內(nèi)研究相比有局限性。FVIII和VWF水平的強(qiáng)遺傳協(xié)調(diào)控能夠進(jìn)行多表型分析，并增加發(fā)現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)能力。