小云一直致力于給粉絲大大們收集、分享各種生信分析的熱點(diǎn)方向和新思路，比如，鐵死亡、銅死亡、失巢凋亡的純生信數(shù)據(jù)挖掘等。這對(duì)于要做基礎(chǔ)研究的臨床醫(yī)生來(lái)講，可謂最具有性價(jià)比的入手方式。

然而，科研是要講連貫性和延伸性的，特別是近年來(lái)競(jìng)爭(zhēng)越來(lái)越大的國(guó)科金申報(bào)，更加注重研究基礎(chǔ)，講求積累和銜接。所以小云推薦，可以追熱點(diǎn)，但是不要一直換熱點(diǎn)，尤其不要盲目換熱點(diǎn)去蹭，打一槍換一個(gè)地方，很難有積累。

每個(gè)研究方向除了剛開(kāi)始提出時(shí)的極端紅利期外，總是會(huì)逐漸走向穩(wěn)定階段的，這是客觀規(guī)律。那么，對(duì)于那些已經(jīng)相對(duì)成熟，且前期我們已經(jīng)投入了不少資源的方向，如何繼續(xù)跟蹤深挖、持續(xù)積累、開(kāi)拓創(chuàng)新了？

小云的絕招是，研究方法和關(guān)注角度的拓展及更新。通過(guò)“嫁接”和“移植”，老樹(shù)可以開(kāi)新花，拓展關(guān)注的視角，以新的角度解釋成熟的內(nèi)容，并且也同時(shí)提高了問(wèn)題的深度，對(duì)于國(guó)科金申報(bào)可謂是事半功倍。（如果沒(méi)有分析思路或者文獻(xiàn)復(fù)現(xiàn)有困難，可以找小云，超多創(chuàng)新性高的分析思路和分析服務(wù)供你選擇?。?/span>

怎么才能做到研究方法和關(guān)注角度的拓展及更新？免疫微環(huán)境+單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘+機(jī)器學(xué)習(xí)是近年來(lái)的常見(jiàn)分析熱點(diǎn)。如下圖可示，“自噬”方向已經(jīng)過(guò)了快速增長(zhǎng)期，22年發(fā)文數(shù)甚至有點(diǎn)小降。那小云就以“自噬”為例，選擇了一篇文獻(xiàn)，來(lái)分享一下如何依賴新的分析方法，實(shí)現(xiàn)自噬在腫瘤里的復(fù)現(xiàn)。

l?題目：鑒定卵巢癌預(yù)后和免疫治療反應(yīng)預(yù)測(cè)的自噬相關(guān)基因

l?雜志：Biomolecules

l?影響因子：IF=6.0

l?發(fā)表時(shí)間：2023年2月

研究背景

卵巢癌（OC）是女性生殖系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤之一，預(yù)后較差。由于患者的個(gè)體特征，在患者中觀察到對(duì)化療和免疫療法等治療的不同反應(yīng)，目前仍缺乏用于風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的預(yù)后標(biāo)志物。自噬與包括 OC 在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但是自噬相關(guān)基因是否可以作為 OC 患者的預(yù)后標(biāo)志物仍有待研究。

數(shù)據(jù)來(lái)源

研究思路

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載374例OC患者的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過(guò)單樣本基因集富集分析 (ssGSEA) 確定了自噬水平與 OC 患者預(yù)后之間的相關(guān)性。通過(guò)免疫組織化學(xué) (IHC) 測(cè)定法檢測(cè)不同臨床標(biāo)本中自噬標(biāo)記物的表達(dá)。應(yīng)用基因集富集分析（GSEA）、ESTIMATE和CIBERSORT分析探討自噬與腫瘤免疫微環(huán)境（TME）的相關(guān)性。對(duì)?OC 患者的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)分析，比較高、低自噬水平的腫瘤細(xì)胞間相互作用模式。利用機(jī)器學(xué)習(xí)、Cox 回歸和 LASSO-Cox 分析用于篩選自噬關(guān)鍵基因，并對(duì)這些基因構(gòu)建預(yù)后模型。

主要結(jié)果

1. 自噬水平與 OC 患者的預(yù)后顯著相關(guān)

作者根據(jù)基因表達(dá)譜矩陣對(duì) OC 患者進(jìn)行自我聚類，發(fā)現(xiàn)可將患者分為自噬水平顯著不同的兩個(gè)簇，而細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡和鐵死亡三種類型的 PCD 中沒(méi)有觀察到這樣的結(jié)果（圖 1A）。Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)自噬水平較高的患者預(yù)后較差（p = 0.0079，圖 1 B)。與自噬水平低的患者相比，自噬水平高的患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的比例更高（圖 1C）。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，OC組織中LC3B和Beclin1的表達(dá)水平升高，而p62的表達(dá)水平降低（圖1 D）。LC3B 和 Beclin1 的表達(dá)水平在順鉑耐藥的 OC 組織中高于順鉑敏感的 OC 組織，并且 p62 的表達(dá)水平被逆轉(zhuǎn)（圖 1 E ）。綜上所述，這些結(jié)果表明自噬水平與 OC 患者的預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)。（ps：熱圖和火山圖也可以用小云新開(kāi)發(fā)的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺(tái)包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來(lái)嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。

圖1自噬水平與 OC 患者的預(yù)后顯著相關(guān)

2. 自噬與 OC 中的免疫微環(huán)境顯著相關(guān)

作者對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行了GSEA分析，發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)信號(hào)在自噬高組中呈正向富集（圖2A），免疫相關(guān)基因（CD28、CD4、CD274、CTLA4、TLR2、TLR4、TICAM2、LCP2、ITK、PTPRC、EGF、JAK1 和 mTOR）的表達(dá)水平在自噬高組中上調(diào)（圖 2B）。其他免疫相關(guān)基因在高自噬亞組中也顯著更高（圖 2 C）。

圖2?自噬與 OC 中的免疫微環(huán)境顯著相關(guān)

ESTIMATE 分析表明，與自噬低組相比，自噬高亞組的免疫評(píng)分升高（p?= 0.024，圖 3A）。CIBERSORT 分析發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性幼稚 B 細(xì)胞、CD4 記憶靜息 T 細(xì)胞和 M2 巨噬細(xì)胞的水平在自噬高組中顯著更高（圖 3?B、C)。通過(guò) IHC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在腫瘤中觀察到更多CD163 信號(hào)（M2 巨噬細(xì)胞）（圖 3?D）。這些數(shù)據(jù)表明自噬水平與 OC 免疫微環(huán)境之間存在相關(guān)性。

圖3?自噬與 OC 中的免疫微環(huán)境顯著相關(guān)

3. ?巨噬細(xì)胞有助于 OC 的自噬相關(guān)免疫微環(huán)境

根據(jù)來(lái)自 scRNA-seq 的基因表達(dá)，為來(lái)自七個(gè)腫瘤組織的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行自噬評(píng)分。UMAP 圖顯示不同細(xì)胞簇的自噬分?jǐn)?shù)存在差異（圖 4 A、B），表明這些細(xì)胞處于不同的自噬水平。此外，通過(guò)配體-受體相互作用評(píng)估研究腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用。在高自噬腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間觀察到更多的配體-受體相互作用（圖 4 C)。有兩個(gè)巨噬細(xì)胞簇，根據(jù)基因表達(dá)鑒定為 M1 樣和 M2 樣（圖 4D、E）。這些數(shù)據(jù)表明自噬可能通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化來(lái)影響 OC 的免疫微環(huán)境。

圖4巨噬細(xì)胞有助于 OC 的自噬相關(guān)免疫微環(huán)境

4. 自噬相關(guān)基因集的獲取及診斷模型構(gòu)建

作者通過(guò)隨機(jī)森林（RF）篩選出30個(gè)與自噬相關(guān)的hub基因，并對(duì)根據(jù)它們?cè)谧允蛇^(guò)程中的重要性進(jìn)行排序（圖 5A）。經(jīng)過(guò)多變量 cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，篩選出8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因（ZFYVE1、AMBRA1、LAMP2、TRAF6、PDPK1、ATG2B、DAPK1 和 TP53INP2）（圖5B)。Kaplan-Meier生存分析顯示，高危組患者（TCGA）的總生存期（OS）明顯短于低危組（p < 0.05）（圖5C、D）。在兩個(gè) GEO 隊(duì)列中驗(yàn)證了自噬相關(guān)特征的預(yù)后價(jià)值，獲得結(jié)果一致（圖 5E）。

圖5?自噬相關(guān)基因集的獲取及診斷模型構(gòu)建

5. 自噬相關(guān)特征基因可用于預(yù)測(cè) OC 的 ICIs 治療效果

作者發(fā)現(xiàn)在IMvigor210隊(duì)列中，抗PD-L1免疫療法有反應(yīng)的患者具有更高的自噬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖6A）。同時(shí)，抗PD-1治療有部分反應(yīng)(PR)的患者表現(xiàn)出比疾病進(jìn)展(PD)患者更高的自噬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖6B）。這一發(fā)現(xiàn)表明，自噬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者可能對(duì)抗PD-L1免疫療法有更好的反應(yīng)。

圖6?自噬相關(guān)特征基因可用于預(yù)測(cè) OC 的 ICIs 治療效果

文章小結(jié)

這篇文章是將“自噬”這個(gè)較為成熟的點(diǎn)和“免疫微環(huán)境”這個(gè)新熱點(diǎn)進(jìn)行整合，再結(jié)合“單細(xì)胞測(cè)序”角度，將自噬再與巨噬細(xì)胞進(jìn)行串聯(lián)，最后結(jié)合使用隨機(jī)森林等“機(jī)器學(xué)習(xí)”分析方法，來(lái)構(gòu)建出基于“自噬”的腫瘤預(yù)后模型。特別適合于前期已有一些研究，后期計(jì)劃進(jìn)行新的探索。不論是項(xiàng)目開(kāi)題（碩士、博士），還是國(guó)自然前期基礎(chǔ)延伸，或者是功能基因的功能試驗(yàn)，都具有重要作用。