寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2020年7月14日發(fā)表于Cell Communication and Signaling（2020IF：5.712，JCRQ2）的一篇文章，通訊作者是Xiangguo Liu教授，研究表明去泛素化酶USP22調(diào)節(jié)人類癌細(xì)胞中的PD-L1降解。

研究背景

????????許多癌癥通過(guò)過(guò)度表達(dá)PD-L1來(lái)逃避免疫監(jiān)視。PD-L1與其受體PD-1相互作用，導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和活化減少，隨后由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡。了解調(diào)節(jié)PD-L1的機(jī)制對(duì)于免疫檢查點(diǎn)阻斷療法(ICBT)至關(guān)重要。

摘要部分

????????作者的數(shù)據(jù)顯示USP22與PD-L1相互作用并促進(jìn)其穩(wěn)定性。USP22去泛素化PDL1并抑制其蛋白酶體降解。此外，USP22還與CSN5相互作用并通過(guò)去泛素化穩(wěn)定CSN5。USP22或CSN5都可以促進(jìn)PD-L1與另一個(gè)的相互作用。此外，USP22去除了CSN5和PD-L1的K6、K11、K27、K29、K33和K63連接的泛素鏈。另一方面，USP22敲低抑制了腫瘤發(fā)生并促進(jìn)了T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。作者還發(fā)現(xiàn)在人類非小細(xì)胞肺癌樣本中，USP22表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)。

研究?jī)?nèi)容

1.USP22調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞中的PD-L1蛋白水平

????????作者在BioGRID數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索了PD-L1的潛在相互作用因子。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)USP22是候選調(diào)節(jié)劑。為了證實(shí)USP22的特異性，作者敲低了H1792和H1299細(xì)胞中的USP4、USP7和USP22。結(jié)果表明，USP22的敲低而不是USP4或USP7的敲低降低了PD-L1蛋白水平。在7個(gè)NSCLC細(xì)胞系中篩選USP22和PD-L1蛋白表達(dá)后，作者發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白水平與USP22表達(dá)呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)暗示USP22可能是PD-L1的有效調(diào)節(jié)器。為了驗(yàn)證作者的假設(shè)，作者在三種NSCLC細(xì)胞系中用不同的siRNA干擾了USP22表達(dá)。

????????USP22的敲低導(dǎo)致內(nèi)源性和外源性PDL1蛋白水平的下調(diào)。在乳腺癌和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中觀察到類似的結(jié)果。一致地，USP22的異位表達(dá)提高了PD-L1蛋白水平?；谶@些結(jié)果，作者認(rèn)為USP22是PD-L1的調(diào)節(jié)器。USP22是SAGA轉(zhuǎn)錄共激活因子復(fù)合物的一個(gè)亞基，因此作者探究USP22是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)PD-L1。然而，PD-L1 mRNA不受USP22敲低的影響。因此，作者想知道USP22是否調(diào)節(jié)PD-L1蛋白降解。蛋白酶體抑制劑MG132挽救了USP22敲低誘導(dǎo)的PD-L1下調(diào)，表明USP22敲低誘導(dǎo)了PD-L1蛋白酶體降解。此外，作者使用放線菌酮(CHX)，一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，來(lái)探索USP22是否影響PD-L1穩(wěn)定性。作者的數(shù)據(jù)顯示USP22敲低降低了PD-L1的穩(wěn)定性，而USP22過(guò)表達(dá)延長(zhǎng)了PD-L1蛋白半衰期。

研究結(jié)論：USP22參與了人癌細(xì)胞中PD-L1的蛋白酶體降解。

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2.USP22與PD-L1直接相互作用

????????已經(jīng)證明USP22可以調(diào)節(jié)PD-L1蛋白水平，作者探究USP22是否與PD-L1相互作用。作者分別在HEK293FT和H157細(xì)胞中進(jìn)行了免疫共沉淀分析，作者發(fā)現(xiàn)USP22與PD-L1相互作用。此外，免疫染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Calu-1細(xì)胞的結(jié)果。因此，作者驗(yàn)證了USP22和PD-L1之間的相互作用。PD-L1由ECD（細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域）、TM（跨膜結(jié)構(gòu)域）和ICD（細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）組成。進(jìn)一步分析表明，USP22的催化C端片段與PD-L1相互作用。此外，PD-L1 ICD結(jié)構(gòu)域具有與USP22的結(jié)合能力。

研究結(jié)論：USP22對(duì)PD-L1的調(diào)節(jié)作用取決于它們的物理相互作用。

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3.USP22調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中PD-L1的去泛素化

????????鑒于USP22是一種去泛素化酶，作者想知道USP22是否調(diào)節(jié)PD-L1去泛素化。為此，作者在HEK293FT和H1299細(xì)胞中進(jìn)行了co-IP實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣，USP22顯著降低了癌細(xì)胞中的PD-L1多泛素化。一致地，在USP22敲低后PD-L1多泛素化升高。值得注意的是，活性位點(diǎn)失活突變體USP22-C185A未能抑制PD-L1多泛素化而不影響其與PD-L1的相互作用。PD-L1的糖基化對(duì)于免疫抑制至關(guān)重要，作者探究PD-L1糖基化是否影響USP22誘導(dǎo)的PD-L1去泛素化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP22抑制了糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化。HRD1（也稱為SYVN1）是一種E3泛素連接酶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ERAD）下PD-L1的泛素化和降解。作者想知道USP22和HRD之間的關(guān)系是否決定了PD-L1泛素化水平和降解。實(shí)際上，USP22減少了HRD1誘導(dǎo)的PD-L1泛素化并保護(hù)PD-L1免受HRD1介導(dǎo)的降解。

研究結(jié)論：USP22通過(guò)其去泛素化活性調(diào)節(jié)PD-L1蛋白的穩(wěn)定性。

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4.USP22與CSN5相互作用并使CSN5去泛素化

????????據(jù)報(bào)道，CSN5是PD-L1的去泛素化酶，作者想探究USP22和CSN5之間相互作用的興趣。作者發(fā)現(xiàn)USP22敲低降低了CSN5蛋白水平而不影響CSN5 mRNA水平。一致地，USP22的異位表達(dá)上調(diào)了CSN5蛋白水平。然而，干擾CSN5表達(dá)對(duì)USP22蛋白水平?jīng)]有影響。類似地，USP22敲低誘導(dǎo)CSN5的蛋白酶體降解。在使用放線菌酮(CHX)抑制蛋白質(zhì)合成時(shí)，USP22敲低確實(shí)降低了CSN5蛋白質(zhì)半衰期，而USP22過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了CSN5穩(wěn)定性。這些數(shù)據(jù)表明USP22穩(wěn)定CSN5而CSN5不能影響USP22蛋白水平。

????????由于CSN5與PD-L1結(jié)合，作者想知道USP22是否與CSN5發(fā)生物理相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明USP22與CSN5外源性和內(nèi)源性相互作用。免疫染色實(shí)驗(yàn)揭示了USP22和CSN5的共定位。此外，USP22可以去除CSN5的多聚泛素鏈，而CSN5似乎對(duì)USP22泛素化沒(méi)有影響。與野生型USP22相比，催化失活的突變體USP22-C185A未能減少CSN5泛素化。作者還通過(guò)USP22用一系列泛素突變體對(duì)CSN5進(jìn)行了徹底的去泛素化分析。與PD-L1類似，USP22移除了CSN5的K6、K11、K27、K29、K33、K63連接的泛素鏈。

研究結(jié)論：USP22與CSN5相互作用并通過(guò)其去泛素化活性穩(wěn)定CSN5蛋白。

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5.USP22與CSN5協(xié)調(diào)以調(diào)節(jié)PD-L1

????????作者已經(jīng)證明USP22使CSN5去泛素化，同時(shí)先前的研究表明CSN5使PD-L1去泛素化，作者認(rèn)為USP22可能通過(guò)USP22-CSN5-PD-L1軸調(diào)節(jié)PD-L1。因此，作者認(rèn)為USP22通過(guò)兩種方式調(diào)節(jié)PD-L1泛素化：第一，USP22直接去除PD-L1泛素化；第二，USP22通過(guò)USP22-CSN5-PD-L1軸調(diào)節(jié)CSN5并調(diào)節(jié)PD-L1泛素化。由于USP22和CSN5都可以與PD-L1結(jié)合并影響其泛素化，作者想知道USP22和CSN5之間存在什么關(guān)系來(lái)影響PD-L1穩(wěn)定性。作者的結(jié)果表明CSN5增強(qiáng)了USP22和PD-L1之間的相互作用。此外，USP22還促進(jìn)了CSN5和PD-L1之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)表明，USP22和CSN5增強(qiáng)了PD-L1與其他藥物的相互作用。然后，作者同時(shí)敲低了H1792細(xì)胞中的USP22和CSN5。作者發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)敲低相比，同時(shí)敲低USP22和CSN5進(jìn)一步下調(diào)了PD-L1蛋白水平。

研究結(jié)論：USP22與CSN5協(xié)同調(diào)節(jié)PD-L1。

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6.抑制Usp22可以抑制腫瘤發(fā)生

????????為了驗(yàn)證USP22在PD-L1調(diào)節(jié)中的作用，作者因此確定了細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。USP22的敲低降低了膜PD-L1水平，如流式細(xì)胞術(shù)所揭示的。PD-L1作為免疫檢查點(diǎn)來(lái)抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷，作者探究USP22敲低是否抑制了腫瘤發(fā)生。與MC38相比，B16-F10表現(xiàn)出更高的PD-L1水平。因此，作者選擇B16-F10來(lái)驗(yàn)證USP22在PD-L1介導(dǎo)的免疫檢查點(diǎn)阻斷中的作用。穩(wěn)定的USP22敲低B16-F10細(xì)胞顯示CSN5和PD-L1表達(dá)降低。USP22敲低抑制了腫瘤發(fā)生而不改變小鼠體重。同時(shí)，在穩(wěn)定的USP22敲低后，腫瘤體積和腫瘤重量顯著減少。

研究結(jié)論：USP22調(diào)節(jié)PD-L1以抑制腫瘤發(fā)生。

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7.USP22通過(guò)PD-L1增強(qiáng)免疫抑制

????????針對(duì)PD-L1和PD-1的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法(ICBT)在多種腫瘤類型中表現(xiàn)出突出的臨床益處。因此，作者探究USP22是否影響由PD-L1-PD1軸引起的免疫抑制。為了進(jìn)行T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，將淋巴細(xì)胞與荷瘤小鼠分離。在與用指定構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的B16-F10細(xì)胞共培養(yǎng)之前，用伴刀豆球蛋白A(conA)刺激T細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)USP22敲低增強(qiáng)了LDH釋放，表明B16-F10細(xì)胞中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷升高，而同時(shí)異位表達(dá)PD-L1以某種方式恢復(fù)了這種效應(yīng)。根據(jù)KMpoltter數(shù)據(jù)庫(kù)，低USP22基因表達(dá)與肺癌患者更好的預(yù)后相關(guān)。USP22對(duì)PD-L1的調(diào)節(jié)可能部分解釋了這種相關(guān)性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證USP22和PD-L1的病理相關(guān)性，作者使用免疫組織化學(xué)染色研究了USP22和PD-L1在241份人類非小細(xì)胞肺癌樣本中的表達(dá)。在67個(gè)PD-L1高表達(dá)的標(biāo)本中，有59.7%檢測(cè)到USP22，而在174個(gè)PD-L1低表達(dá)的標(biāo)本中只有37.9%檢測(cè)到USP22。

研究結(jié)論：USP22可以作為提高基于ICBT的癌癥治療效率的靶標(biāo)。

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結(jié)論與討論

????????在這里，作者確定USP22是PD-L1的新調(diào)節(jié)器。一方面，USP22可以通過(guò)去泛素化直接調(diào)節(jié)PD-L1的穩(wěn)定性。另一方面，USP22通過(guò)USP22-CSN5-PD-L1軸調(diào)節(jié)PD-L1蛋白水平。此外，USP22敲低抑制了腫瘤發(fā)生并促進(jìn)了T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，在人類非小細(xì)胞肺癌樣本中,USP22表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)。作者確定了一種新的PD-L1調(diào)節(jié)器，并描述了USP22在PD-L1介導(dǎo)的免疫逃避中的重要作用。USP22作為靶標(biāo)可能是ICBT的新治療方案。

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Thank you!

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原文鏈接：

https://biosignaling.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12964-020-00612-y