質(zhì)譜分析技術(shù)有著高靈敏度，高精準(zhǔn)度等特點，能夠準(zhǔn)確快速地鑒定蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)僅限于小分析物質(zhì)的分析，隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）等，為準(zhǔn)確快速鑒定蛋白質(zhì)等大分子提供了便捷的條件。目前，酶切蛋白質(zhì)，液相色譜分離肽段，串聯(lián)質(zhì)譜分析多肽氨基酸序列，聯(lián)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析已成為了鑒定蛋白質(zhì)的首選方案。本文主要講下蛋白質(zhì)譜鑒定的原理和應(yīng)用。

一、MALDI-TOF

基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight, MALDI-TOF）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān)系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時間（TOF）檢測器來檢測， 理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的， 因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的研究。

技術(shù)特點

? MALDI-TOF 鑒定方便、快速，可以同時做上百個斑點

? 主要用于純蛋白或簡單樣本的鑒定，如2DE斑點

? 成本較低

樣品要求

? 蛋白質(zhì)溶液：純度> 90%；蛋白質(zhì)總量> 5 ug，濃度> 0.1 ug/ul

? 雙向凝膠電泳點：考染、銀染點清晰可見

? SDS-PAGE膠條：單一蛋白質(zhì)，考染、銀染條帶清晰可見

二、ESI-MS

電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。

技術(shù)特點

? 高通量：一次可鑒定數(shù)十至數(shù)百種蛋白質(zhì)

? 靈敏度高：可檢測樣品濃度極低的膠點

? 通用性強：可分析蛋白質(zhì)條帶、免疫共沉淀洗脫液、組織提取液、全細(xì)胞裂解液、亞細(xì)胞分離組分等多種形式的樣品

樣品要求

? 蛋白質(zhì)溶液：蛋白質(zhì)總量>5 ug，濃度>0.1 ug/ul。緩沖液中不含去污劑NP40、Triton X-100等。

? SDS-PAGE膠條：考染、銀染條帶清晰可見。

制備質(zhì)譜檢測樣品注意事項：

? 樣本制備過程應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融

? 配膠和切膠避免角蛋白污染，配膠試劑專用，切膠刀具使用干凈一次性的

? 蛋白考染，一般肉眼可見的量都是可以被質(zhì)譜鑒定到的

? 銀染的蛋白質(zhì)不能使用戊二醛作為固定劑，因為戊二醛使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆交聯(lián)，會影響質(zhì)譜鑒定結(jié)果

質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用

1. 蛋白質(zhì)純度分析以及分子量測定

MALDI-TOF是一種軟電離技術(shù)，可用于檢測目標(biāo)蛋白或多肽是否存在,有無二聚體存在,以及進行純度情況的大體評估。MALDI-TOF鑒定分子量范圍也非常廣，能夠鑒定700-60000Da的蛋白分子量，準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%~0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)。

2. 蛋白指紋譜鑒定（PMF）

肽質(zhì)量指紋譜（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白質(zhì)被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的肽片段的質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)）都不同，當(dāng)?shù)鞍妆凰夂?，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，因此其肽質(zhì)量指紋圖也具有特征性。將肽譜圖與數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)理論太譜圖對比，從而鑒定蛋白質(zhì)的身份。因此，分子質(zhì)量的精確度是PMF的關(guān)鍵指標(biāo)所在，但蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可能使PMF的質(zhì)量數(shù)與理論值不符，從而對蛋白鑒定的準(zhǔn)確度有一定影響。

3. MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜法測序

串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)，是目前常用的質(zhì)譜鑒定方式。MS/MS先通過一級質(zhì)譜測定肽段質(zhì)量，再選取豐度高的肽段進行二級質(zhì)譜分析，在二級質(zhì)譜中肽段相互碰撞導(dǎo)致氨基酸鍵斷裂，產(chǎn)生肽段碎片離子經(jīng)由檢測器分析，從而得到篩選肽段的氨基酸序列信息。MS/MS利用豐富肽段碎片的精確質(zhì)量信息，更具有特異性、可信度，極大地增加了數(shù)據(jù)庫檢索的可靠性。