隨著高分辨率質(zhì)譜儀分析技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的方法已經(jīng)相當純熟，一次性鑒定多個蛋白樣品，以及低豐度蛋白樣品已經(jīng)不再是難事。但是因為質(zhì)譜的靈敏度高，外來引入的蛋白質(zhì)可能會造成質(zhì)譜鑒定的假陽性，因此，在蛋白樣品的準備過程中要注意避免引入外來蛋白污染物。另外，蛋白樣品的準備也需要使用與質(zhì)譜儀檢測兼容的溶液和試劑，這樣可以極大提高質(zhì)譜儀鑒定的準確度。在這期小編就來給大家介紹蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定前的樣品準備注意事項。

1. 蛋白質(zhì)樣品制備和質(zhì)譜鑒定流程

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的一般流程

1. 首先對細胞或組織樣品進行破碎，破碎的方法有很多種。大多數(shù)細胞可以通過選用常用的細胞裂解試劑，例如RIPA buffer，添加蛋白酶抑制劑和還原劑，來裂解細胞。組織則可以通過低溫勻漿，液氮冷凍研磨等方法破碎組織細胞。

2. 接著12，000 rpm，4度高速離心10分鐘，去除不可溶的細胞組分

3. 液體蛋白樣品可以使用抗體進行富集，提純，以及IP處理，再濃縮待檢測的蛋白；也可以使用1D/2D-PAGE gel分離蛋白。

4. 濃縮后的液體蛋白經(jīng)過酶切后，再使用LC-MS/MS分析；蛋白膠樣則需要切下與目的蛋白分子量一致的蛋白條帶，再對蛋白進行in-gel酶切和質(zhì)譜檢測分析。

5. 對質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)進行分析獲得可信度高的蛋白肽段序列，再與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對獲得蛋白質(zhì)ID

2. 樣品類型

細胞樣品：動物細胞，植物細胞，真菌和細菌等微生物細胞

組織樣品：動物組織，植物組織

體液樣品：血清、血漿、尿液等

3. 樣品用量

4. 注意事項

蛋白質(zhì)樣品可以用沉淀，膜分離，分離柱，冷凍干燥等各種方式進行濃縮， 用戶應根據(jù)樣品的特點選擇合適的方法共列，用SDS樣品液可以從色譜樣上中洗脫蛋白，從而保持樣本體積小。

4.2. 電泳凝膠:

對于SDS- PAGE，傳統(tǒng)的Laemmli式，三甘氨酸凝膠及其各種改進型的凝膠，如二，三凝膠或三鹽酸凝膠， 都可以兼容于蛋白質(zhì)鑒定。各種凝膠濃度也沒有限制。用戶選擇凝膠的類型和濃度液，應根據(jù)對樣本的分離效果好來決定。

4.3. 蛋白膠染色：

? Coomassie Blue, SYPRO Ruby 以及Silver stain樣品均可進行蛋白的鑒定試驗；

? 銀染的樣品有可能與后續(xù)的質(zhì)譜分析不兼容，我們推薦您使用下面的產(chǎn)品或者實驗步驟進行銀染實驗：

ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)

Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)

? 另外，銀染的樣品請不要進行脫色處理

4.4. 液體樣品：

樣品準備過程中盡量減少SDS等表面活性劑的使用，并注意降低鹽濃度。如果您提交IP洗脫樣品，我們推薦使用HPH EB (0.5 M NH4OH, 0.5 mM EDTA) 緩沖體系進行l(wèi)ast step蛋白的洗脫，保證洗脫緩沖體系與后續(xù)的質(zhì)譜實驗兼容。

4.5. 切割蛋白帶:

凝膠在切割過程中應避免與手，燈箱， 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接觸。在切割蛋白膠帶適應盡量避免割下空白凝膠（它可能會降低酶切的消化效率和多肽的回收率）。 將每個凝膠帶置于干凈的，1.5毫升的微型離心管并給每個樣本小心地做上標簽。