摘要

1962年從水母Aequorea victoria中發(fā)現(xiàn)并提取出的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）以及1999年從珊瑚Discosoma genus中發(fā)現(xiàn)的紅色熒光蛋白（drFP583）現(xiàn)已成為在生物研究中的各個(gè)領(lǐng)域最為廣泛的蛋白質(zhì)之一。由于其具有對(duì)生物體無(wú)毒無(wú)害、受特定波長(zhǎng)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射特征熒光、分子量小、易于構(gòu)建載體以及在多種生物體中均可表達(dá)的特性，在眾多領(lǐng)域中展現(xiàn)出了廣闊的前景?，F(xiàn)已有多種熒光蛋白被應(yīng)用于實(shí)際研究中。

關(guān)鍵詞

熒光蛋白，發(fā)光機(jī)理，發(fā)色團(tuán)，研究歷史

1? ）熒光蛋白的研究歷史

綠色熒光蛋白是第一種被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白。1962年，日本科學(xué)家下村修從首次從維多利亞多管水母（Aequorea victoria）中發(fā)現(xiàn)并分離出了綠色熒光蛋白。起初，綠色熒光蛋白是作為下村修提取水母素的副產(chǎn)物出現(xiàn)。其在陽(yáng)光下呈現(xiàn)綠色、鎢絲下呈黃色強(qiáng)烈，而在紫外光下表現(xiàn)出強(qiáng)烈綠色。通過(guò)生物化學(xué)的方法和對(duì)光譜的研究，下村修初步解析了綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理及發(fā)光基團(tuán)[1]。然而，作為發(fā)現(xiàn)者的下村修并沒(méi)有意識(shí)到自己的發(fā)現(xiàn)將會(huì)在三十年后引起現(xiàn)代生物技術(shù)的一場(chǎng)變革。在之后不久，下村修便放棄了對(duì)綠色熒光蛋白的進(jìn)一步研究而選擇將研究方向轉(zhuǎn)移至其他的領(lǐng)域。

1985年至1992年間，普拉舍成功完成了綠色熒光蛋白的基因及蛋白質(zhì)序列的測(cè)定，并以此為基礎(chǔ)，由道格拉斯·普瑞舍于1992年成功克隆出綠色熒光蛋白的基因。首個(gè)將綠色熒光蛋白應(yīng)用于生物學(xué)研究的是哥倫比亞大學(xué)的馬丁·查爾菲。1994年，通過(guò)分子生物學(xué)的方法，查爾菲將綠色熒光蛋白的cDNA導(dǎo)入線蟲(chóng)等模式生物并成功使其得到表達(dá)，使人們意識(shí)到GFP作為報(bào)告基因的巨大潛力。同年，錢(qián)永健團(tuán)隊(duì)成功解析了綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制，并通過(guò)突變對(duì)GFP進(jìn)行改造，得到了一些熒光亮度更高、吸收峰單一、構(gòu)象折疊效率更高的熒光蛋白突變體，如GFP-S65T[2]。

1999年，繼綠色熒光蛋白（GFP）之后的第二種類型的熒光蛋白——紅色熒光蛋白（drFP583）首次得到報(bào)告。這是一種由Matz等人從大平洋地區(qū)的珊瑚（Discosoma genus）中提純出來(lái)的一種蛋白質(zhì)四聚體，在紫外線的照射下可發(fā)出紅色熒光。由于其具有發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)、靈敏度與信噪比較高等優(yōu)點(diǎn)，為基于GFP的體內(nèi)研究提供了一個(gè)很好的互補(bǔ)工具。但是，drFP583本身具有的缺點(diǎn)、如寡聚化、成熟作用緩慢及對(duì)細(xì)胞存在毒性等限制了其使用。目前在實(shí)際研究中使用較多的是有Clontech公司生產(chǎn)的經(jīng)過(guò)人為改造的低細(xì)胞毒性、低寡聚化及快速成熟的突變體E57-NA（商品名為DsRed）。如今，隨著DsRed的修飾和改進(jìn)，其應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣，而且它與GFP相結(jié)合，為分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了一個(gè)新的、快捷的檢測(cè)手段[3]。

2 ）?熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理

2.1 ?熒光蛋白的結(jié)構(gòu)

2.1.1綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)

野生型綠色熒光的一級(jí)結(jié)構(gòu)已由對(duì)應(yīng)的cDNA序列推測(cè)出來(lái)。其一級(jí)序列含有238個(gè)氨基酸殘基，分子量約為27 kDa[2]。根據(jù)對(duì)制備出的晶體進(jìn)行的X-光衍射圖像分析得知[4]，可以得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)為一個(gè)高約為4 nm，直徑為3 nm的筒狀結(jié)構(gòu)。

圓柱體的筒壁由11條β-折疊環(huán)繞折疊而成。β-折疊彼此之間緊密結(jié)合，并且形成規(guī)則的氫鍵帶。而其中一端則由一個(gè)小的α螺旋封閉，使之成為一個(gè)一元開(kāi)口的密集體，稱之為β罐。

同時(shí)，在結(jié)構(gòu)上封閉一端的α螺旋向內(nèi)延伸至中軸處成為發(fā)色團(tuán)的支架。發(fā)色團(tuán)處于整個(gè)結(jié)構(gòu)的核心部位，受到外周β-折疊片層的保護(hù)。這樣的結(jié)構(gòu)保證了整個(gè)構(gòu)造具有高度穩(wěn)定性，并且極大程度提高了核心發(fā)色團(tuán)對(duì)熱、酸、堿以及變性劑等因素的強(qiáng)的抵抗能力[5]。但同時(shí)，這樣致密的結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致了酶或者輔因子難以進(jìn)去GFP的內(nèi)部催化發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)生。這使得發(fā)色團(tuán)的形成時(shí)只能依靠自催化產(chǎn)生。

綠色熒光蛋白的發(fā)色團(tuán)由65-67位的Ser-Tyr-Gly三聚體殘基形成。三聯(lián)體的側(cè)鏈自動(dòng)催化環(huán)化構(gòu)成4-（對(duì)-羥基苯亞甲基）咪唑-5-啉酮的結(jié)構(gòu)形成GFP的核心發(fā)色團(tuán)。

發(fā)色團(tuán)的形成過(guò)程[7]是一個(gè)自催化環(huán)化的過(guò)程，不需要酶或輔因子的參與。在發(fā)色團(tuán)形成時(shí)，首先Ser65和Gly67快速環(huán)化形成咪唑啉-5-酮中間體，然后由O2緩慢氧化Tyr66的側(cè)鏈形成一個(gè)雙鍵。這一步較為緩慢，往往需要持續(xù)數(shù)個(gè)小時(shí)。67位的Gly對(duì)于發(fā)色團(tuán)的形成時(shí)必須的，沒(méi)有任何一個(gè)氨基酸可以取代Gly67存在。其次，該反應(yīng)對(duì)溫度敏感，當(dāng)反應(yīng)溫度＞30 ℃時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率將會(huì)下降。這可能與水母自然條件下生活環(huán)境的溫度較低有關(guān)。已生成的生色團(tuán)本身對(duì)熱有較強(qiáng)的抵抗力，發(fā)色團(tuán)一旦生產(chǎn)，他就是熱穩(wěn)定的。

現(xiàn)已經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)[7]，GFP一級(jí)結(jié)構(gòu)的2-232個(gè)氨基酸對(duì)維持蛋白質(zhì)的發(fā)光特性是必需的。截短C-末端7個(gè)以上或N-末端兩個(gè)以上氨基酸將會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的熒光特性全部丟失。最后七個(gè)氨基酸殘基無(wú)序，不參與構(gòu)成蛋白的具體結(jié)構(gòu)，因此，在該部分的氨基酸缺失或者額外增添不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)整體的功能造成影響；N-末端的氨基酸參與形成了β罐一端的“帽子”結(jié)構(gòu)，對(duì)于發(fā)色團(tuán)具有保護(hù)作用，是不可缺少的部分，但在N-末端延長(zhǎng)肽鏈并不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。但當(dāng)GFP與某些蛋白組成融合蛋白時(shí)，C-末端缺失部分氨基酸殘基并不會(huì)造成蛋白質(zhì)熒光特性的缺失，但對(duì)光譜特性仍有一定影響[5]。

綠色熒光蛋白在在晶體中或在離子強(qiáng)度低于100?mmol／L的溶液中可發(fā)生二聚化。二聚化對(duì)于自然狀態(tài)下的GFP與水母熒光蛋白間能量的傳遞具有促進(jìn)作用。

?

2.1.2 ?紅色熒光蛋白（DsRed）的結(jié)構(gòu)

DsRed由225個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為25.9 KDa。作為一種從珊瑚蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白質(zhì)，其一級(jí)序列與從維多利亞多管水母中發(fā)現(xiàn)的綠色熒光蛋白（GFP）同源性很低，僅為23%左右。但其二者的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。同GFP一樣，DsRed在二級(jí)結(jié)構(gòu)上同樣形成了β罐的結(jié)構(gòu)。

DsRed蛋白的發(fā)色團(tuán)由Gln66-Tyr67-Gly68構(gòu)成。在結(jié)構(gòu)上與GFP的發(fā)色團(tuán)具有高度的相似性。在發(fā)色團(tuán)的體外成熟過(guò)程中，可觀測(cè)到發(fā)色團(tuán)的最初的激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm與499 nm（表現(xiàn)為綠色熒光）。約7個(gè)小時(shí)之后，綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，隨后便開(kāi)始衰減。2天后，綠色熒光完全小時(shí)，隨后紅色熒光才開(kāi)始緩慢產(chǎn)生。經(jīng)分析，DsRed的發(fā)色團(tuán)形成過(guò)程中，需要先形成一個(gè)與GFP發(fā)色團(tuán)基本上一致的結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)一步氧化形成DsRed的發(fā)色團(tuán)。與GFP的發(fā)色團(tuán)相比，DsRed的發(fā)色團(tuán)具有一個(gè)亞胺的結(jié)構(gòu)[9]。亞胺的雙鍵進(jìn)一步擴(kuò)大的發(fā)色團(tuán)的共軛體系范圍，使發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。

晶體學(xué)分析得知，DsRed在正常狀態(tài)下以四聚體的狀態(tài)存在。并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DsRed的發(fā)色團(tuán)只有在寡聚化的情況下才能形成及發(fā)揮作用。對(duì)DsRed堿變性、酸變性及胍變性實(shí)驗(yàn)表明，DsRed的發(fā)色團(tuán)要經(jīng)過(guò)幾步折疊才可形成，而寡聚化在它的成熟過(guò)程中起重要的作用[3]。

2.2 熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理

現(xiàn)有研究已證實(shí)，目前所發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理大同小異。GFP作為最早被發(fā)現(xiàn)并研究的熒光蛋白，關(guān)于其發(fā)光機(jī)理方面的研究已趨于完善。因此，此部分主要論述GFP的熒光發(fā)生機(jī)理。

在維多利亞多管水母體內(nèi)中，熒光蛋白的熒光產(chǎn)生是與另一種發(fā)光蛋白—水母發(fā)光蛋白相互耦聯(lián)作用。

水母熒光蛋白以水母熒光素為輔基，在鈣離子作用下可以發(fā)出460-470 nm藍(lán)光。

水母熒光蛋白在鈣離子存在時(shí)，受氧氣氧化釋放出的藍(lán)光經(jīng)F?rster循環(huán)將能量傳遞給GFP的發(fā)色團(tuán)，隨后GFP的發(fā)色團(tuán)受激發(fā)釋放出綠色熒光蛋白特有的綠色熒光（509 nm）。

現(xiàn)在一般認(rèn)為，GFP的熒光產(chǎn)生是經(jīng)過(guò)一個(gè)稱為ESPT（激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移）[11]的過(guò)程，其熒光產(chǎn)生的核心在于發(fā)色團(tuán)中的Tyr66的支鏈酚部。由于酚具有微弱的酸性，存在中性狀態(tài)與離子狀態(tài)的互變，并且在一般情況下，中性狀態(tài)是優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，二者以大概6:1的比例存在。但當(dāng)發(fā)色團(tuán)

受光激發(fā)時(shí)，基團(tuán)的酸性將會(huì)大幅增加，發(fā)色團(tuán)周圍的微環(huán)境中氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)之間以及氨基酸殘基側(cè)鏈與水分子之間共同組成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)的變化在這個(gè)過(guò)程中起到了決定性的作用[12]。

晶體學(xué)的分析顯示，在非激發(fā)狀態(tài)下，Tyr66酚羥基呈中性狀態(tài)，Glu222羧基的靜電斥力和與被束縛的水分子Wat304、Ser205側(cè)鏈氧之間形成的氫鍵共同維持這一種狀態(tài)。Glu222與Ser65之間的狀態(tài)可對(duì)這一種狀態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步穩(wěn)定。

當(dāng)進(jìn)入激發(fā)態(tài)時(shí)，由Glu222通過(guò)與Wat304和Ser205構(gòu)成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)向發(fā)色團(tuán)酚羥基傳遞一個(gè)負(fù)電荷，酚羥基的質(zhì)子同時(shí)傳遞出去。大部分情況下，接受電荷的發(fā)色團(tuán)將發(fā)生光異構(gòu)化，隨后釋放出504 nm的輻射會(huì)回到基態(tài)并重新轉(zhuǎn)變?yōu)橹行誀顟B(tài)。

但在少數(shù)情況下，通過(guò)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的變化將會(huì)將發(fā)色團(tuán)穩(wěn)定在離子態(tài)。His148側(cè)鏈與Tyr66酚氧（Oη）之間形成的氫鍵、Wat304和Tyr66 Oη以及Thr203側(cè)鏈氧、Ser205的側(cè)鏈氧將會(huì)形成新的氫鍵網(wǎng)絡(luò)以穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)的狀態(tài)。同時(shí)，Glu222和Ser205之間的氫鍵發(fā)生斷裂，Glu222的羧基氧也可能會(huì)發(fā)生順?lè)串悩?gòu)化。

3? ）熒光蛋白的改造

野生型的熒光蛋白具有發(fā)光強(qiáng)度低、折疊易受溫度影響、產(chǎn)生熒光具有滯后性以及具有細(xì)胞毒性（drFP583）等缺陷，因此目前人們使用的熒光蛋白大多經(jīng)過(guò)改造。對(duì)于熒光蛋白的改造一般圍繞發(fā)色團(tuán)來(lái)展開(kāi)。其基本思路分兩類：一是直接對(duì)發(fā)色基的進(jìn)行化學(xué)修飾從而直接影響發(fā)色團(tuán)的光化學(xué)性質(zhì)；二是通過(guò)對(duì)構(gòu)成發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境的氨基酸進(jìn)行替換通過(guò)微環(huán)境的改變進(jìn)而影響發(fā)色團(tuán)的熒光性質(zhì)。這里簡(jiǎn)單介紹幾種常見(jiàn)的改造后熒光蛋白[11]。

3.1 ?增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（EBFP）

將野生型的GFP的Tyr66替換為His，使用咪唑基取代原本的酚基。這一突變使得激發(fā)與發(fā)射光譜相對(duì)于原本GFP發(fā)生藍(lán)移（激發(fā)波長(zhǎng)：383 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：445 nm）。并且將Val150突變?yōu)長(zhǎng)le、Val224突變?yōu)锳rg以填補(bǔ)組氨酸替換酪氨酸留下的空洞，增強(qiáng)發(fā)光基團(tuán)的穩(wěn)定性。

3.2 ?增強(qiáng)型青色熒光蛋白（ECFP）

青色熒光蛋白的產(chǎn)生與藍(lán)色熒光蛋白在改造思路上一致，將Tyr66的酪氨酸改造為色氨酸將會(huì)在發(fā)色基中引入一個(gè)吲哚。此時(shí)發(fā)色團(tuán)的的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)入到野生型GFP的中性酚狀態(tài)下與離子酚狀態(tài)下的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)之間，呈現(xiàn)出藍(lán)綠色的特征熒光（Ex：439 nm，Em：476 nm）。此外，使用天冬氨酸取代His148以消除Tyr145與His148之間的交換，穩(wěn)定蛋白的第一構(gòu)象狀態(tài)。若進(jìn)一步將Tyr145替換為Ala則有利于增強(qiáng)突變體的熒光強(qiáng)度。S72A突變?cè)诩铀侔l(fā)色團(tuán)的成熟方面有重要作用。

3.3 ?增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）

EYFP的產(chǎn)生主要依賴于對(duì)野生型GFP的發(fā)色團(tuán)周圍微環(huán)境的改造。相對(duì)于avGFP，最大的突變?cè)谟谑褂美野彼崛〈薚hr203。當(dāng)熒光蛋白折疊時(shí)，Tyr203的酚基將會(huì)伸入到熒光蛋白內(nèi)部的空腔，并且與發(fā)色團(tuán)的酚基團(tuán)在空間上形成了π-π疊加相互作用。這種突變穩(wěn)定了發(fā)色團(tuán)的激發(fā)態(tài)偶極矩，從而使得GFP的吸收光譜和發(fā)射光譜整體向長(zhǎng)波方向平移約20 nm左右。另外Gln69向Lys的突變?cè)鰪?qiáng)了發(fā)色基的離子化，將發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向進(jìn)一步移動(dòng)了1-2 nm。

3.4 ?Superfolder GFP

Superfolder?GFP整合了9個(gè)點(diǎn)突變：S30R、Y39N、F99S、N105T、Y145F、M153T、V163A、I171V以及A260V。相比于野生型的GFP，Superfolder GFP具有更好的穩(wěn)定性及更高效的折疊動(dòng)力學(xué)（能在37 ℃條件下高效折疊），亮度也比EGFP要高，同時(shí)表現(xiàn)出相比與GFP家族其他成員更強(qiáng)的抗酸堿性。

?

3.5 ?橙色熒光蛋白（mOrange）

mOrange是mFruit熒光蛋白家族的成員之一，其特征吸收與發(fā)生光譜分別為548nm與562 nm。mFruit家族作為DsRed紅色熒光蛋白改造后產(chǎn)物，相對(duì)而言具有不寡聚化、毒性低、亮度高、成熟快等優(yōu)點(diǎn)。mOrange的橙色熒光是由于發(fā)色團(tuán)在形成時(shí)在Thr66處形成了惡唑環(huán)而產(chǎn)生。惡唑環(huán)的形成降低了65位的羰基的共軛，從而導(dǎo)致了吸收光譜與發(fā)射光譜相對(duì)于野生型的藍(lán)移現(xiàn)象。

4?）?評(píng)述

從最初發(fā)現(xiàn)的種類單一的綠色熒光蛋白，到如今多種多樣具有多種不同光譜特性的熒光蛋白可供生物工作者選擇，熒光蛋白在某種定義下可以說(shuō)是革新了生物學(xué)研究，為生命科學(xué)研究提供了極為有效的方法，具有劃時(shí)代的意義。熒光蛋白作為一種新型的優(yōu)良標(biāo)記物，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。相信對(duì)熒光蛋白研究的進(jìn)一步深入，必將為其應(yīng)用開(kāi)辟更廣闊的前景。

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作者：極地冰川?

審核：未名