研究藥物作用機制，可為藥物研發(fā)提供新的思路和方法。今天小微跟大家分享一篇干濕結合的藥物作用機制研究的文章，實驗設計思路值得大家參考，一起來看看吧~

研究背景

骨關節(jié)炎（OA）是一種常見的慢性疼痛性關節(jié)炎，目前尚無根治方法，但藥物治療仍然是主要的治療手段，因此研究藥物的作用機制對臨床診斷和治療非常重要。青蒿素（AT）是一種廣為人知的抗瘧疾藥物，有研究發(fā)現(xiàn)，AT可以緩解OA，但具體分子機制不清楚。

技術路線

主要結果

1.AT在IL-1β誘導的軟骨細胞中發(fā)揮抗炎和軟骨保護作用

細胞處理：

將不同濃度的AT（0、2.5、5、10或20 μM）與IL-1β 一起加入軟骨細胞中，孵育0、24、48和72 h，以確定AT是否影響正常和OA軟骨。

指標檢測：

（1）研究AT對OA軟骨細胞增殖的影響

結果：CCK8檢測發(fā)現(xiàn)0-10 μM AT對OA軟骨細胞增殖有輕微促進作用，而20 μM AT對OA軟骨細胞增殖有顯著促進作用。因此，最佳濃度為20 μM （圖1A）。

（2）研究AT對IL -1β誘導的軟骨細胞的抗炎和軟骨保護作用

結果：WB和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)AT以劑量依賴的方式顯著抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-a的表達（圖1B-C） ；降低軟骨基質相關蛋白ADAMTSS、MMP-3和MMP-13的表達（圖1D-E）。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)AT降低IL -1β誘導的軟骨細胞中MMP-3的表達。

2.差異表達基因鑒定及基因集富集分析

RNA測序：

對象：IL-1β組和IL-1β+ AT（20 μM）組軟骨細胞

分析指標：

差異表達分析

結果：AT處理后大部分基因下調（圖2A-B），最顯著下調表達的基因是TNFSF11（圖2E）。

（2） GSEA和KEGG分析負調控基因的基因富集分析

結果：對差異倍數(shù)至少2倍，p≤0.05的差異表達基因進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，AT治療抑制了骨關節(jié)炎軟骨細胞中的PI3K-AKT-mTOR通路（圖2C-D)。

3.TNFSF11在OA中表達上調，在AT治療后表達下調

細胞分組:?Control組、IL-1β組、AT + IL-1β組

指標檢測：檢測TNFSF11的表達

結果：免疫熒光染色、 qPCR和免疫組化分析結果顯示，IL-1β組TNFSF11表達高于對照組，IL-1β + AT組TNFSF11表達明顯低于IL-1β組，提示IL-1β誘導的OA中TNFSF11表達上調，而AT治療后TNFSF11表達下調（圖3A-C）。

4.AT可激活IL-1β誘導的軟骨細胞線粒體自噬和抑制PI3K/AKT/mTOR通路活化

細胞處理：將不同濃度的AT（5、10或20 μM）與IL-1β 一起孵育軟骨細胞。

指標檢測：

（1）探究AT在OA軟骨細胞自噬激活中的作用

結果：qPCR和WB檢測IL-1β誘導的OA中自噬相關基因beclin-1、ATG5、ATG7和LC3顯著下調; 免疫熒光染色檢測IL-1β誘導的OA中自噬相關基因beclin-1下調。而AT治療后這些基因上調（圖4A-D）。

（2）探究AT 在線粒體中的功能

結果：免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，AT以劑量依賴的方式激活線粒體。

（3）探究AT對OA軟骨細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

結果：WB檢測發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導的OA中通路蛋白顯著上調，而AT治療后這些通路蛋白下調（圖4F-G）。

5.AT通過下調TNFSF11抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化來激活線粒體自噬，從而緩解軟骨退化和缺損

細胞處理：將AT與IL-1β 一起孵育軟骨細胞后，進一步聯(lián)合使用mTOR激活劑MYH1485或者過表達TNFSF11處理。

指標檢測：

（1）探究聯(lián)合使用mTOR激活劑MYH1485或者過表達TNFSF11是否逆轉了AT引起的通路抑制和自噬激活。

結果：WB檢測發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用mTOR激活劑MYH1485或過表達TNFSF11逆轉了AT對PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達的抑制（圖5A-B）和AT引起的自噬激活（自噬相關蛋白表達降低）（圖5C-E）。免疫熒光顯示過表達TNFSF11逆轉了AT對線粒體功能的影響 （圖5F）。

（2）探究聯(lián)合使用mTOR激活劑MYH1485或者過表達TNFSF11是否逆轉了AT的抗炎和軟骨保護作用。

結果：qPCR顯示過表達TNFSF11逆轉了AT對炎癥因子TNF-a和基質降解相關蛋白MMP3和ADAMTS5的表達的抑制（圖5G-H）。

6.AT可減輕OA模型大鼠軟骨退化和激活自噬

動物處理：

建立了大鼠OA模型，在OA大鼠和正常大鼠膝關節(jié)注射AT，持續(xù)4周。

指標檢測：

驗證AT對OA模型大鼠軟骨退化保護和自噬激活的作用

結果：組織學評估：HE和Safranin-O 染色顯示，與OA組相比，OA+AT組軟骨破壞度降低（圖6A-B）。免疫組化顯示，與OA組相比，OA+AT組MMP3表達降低，ATG5表達升高（圖6C-D），說明AT可減輕OA模型大鼠軟骨退化和激活自噬。微計算機斷層掃描發(fā)現(xiàn)AT治療減弱了OA（圖6E）。

作用機制

在IL-1β誘導的OA中，AT抑制TNFSF11的表達，抑制PI3K-AKTmTOR通路。在沒有AT的情況下，TNFSFI1激活PI3K-AKT-mTOR通路，抑制IL-1β誘導的OA自噬。在AT存在的情況下，下調的TNFSF11抑制PI3K-AKT-mTOR通路，促進IL-1 β誘導的OA自噬（圖7）

以上就是今天分享的主要內容啦，本研究首先通過整合不同的基因表達數(shù)據集或者測序數(shù)據和KEGG數(shù)據庫等工具，預測藥物與特定基因或通路的相互作用，然后開展一系列的實驗驗證藥物作用的基因和通路。而且，本研究還結合了線粒體自噬熱點進行分析，為文章增色不少。