? ? ? ? 杜鵑：今天介紹的是酵母人工染色體(Yeast Artificial Chromosome/YAC)。它是第一個真核細(xì)胞染色體型的人工染色體，也是人類人工染色體的“母親”。

簡介

? ? ? ?酵母人工染色體(YACs)是從酵母的DNA中提取的基因工程染色體，然后連接到細(xì)菌質(zhì)粒。通過插入100-1000kb的大片段DNA，插入的序列可以被克隆，并使用一種稱為染色體行走的過程進行物理映射。這是最初用于人類基因組計劃的過程，但是由于穩(wěn)定性問題，YACs被放棄使用細(xì)菌人工染色體(BAC)。從Rankin et al.、Strul et al.和Hsaio et al.的初步研究開始，固有脆弱的染色體通過發(fā)現(xiàn)必要的自主復(fù)制序列(ARS)而穩(wěn)定；是Murray et al.在1983年利用這一數(shù)據(jù)描述的精制YAC。

? ? ? ? YAC的主要成分是釀酒酵母的ARS、著絲粒和端粒。此外，可選擇的標(biāo)記基因，如抗生素耐藥性和可見的標(biāo)記，被用來選擇轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。沒有這些序列，染色體在細(xì)胞外復(fù)制過程中就不會穩(wěn)定，也就無法與沒有載體的菌落區(qū)分開來。

構(gòu)建過程

? ? ? ?YAC是用一個初始的環(huán)狀DNA質(zhì)粒構(gòu)建的，通常用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切成線性DNA分子;然后用DNA連接酶將DNA序列或感興趣的基因連接到線性化的DNA中，形成單個大的圓形DNA片段線性酵母人工染色體的基本生成可分為6個主要步驟：

? ? ? ? 1.將可選擇的標(biāo)記連接到質(zhì)粒載體：這允許有或沒有標(biāo)記基因的菌落的差異選擇。一種抗生素抗性基因允許在大腸桿菌中通過拯救突變大腸桿菌在生長培養(yǎng)基中必要成分的存在下合成亮氨酸的能力來擴增和選擇YAC載體。TRP1和URA3基因是其他可選擇的標(biāo)記。外源DNA的YAC載體克隆位點位于SUP4基因內(nèi)。這種基因補償了酵母宿主細(xì)胞中引起紅色素積累的突變。宿主細(xì)胞通常是紅色的，只有YAC轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會形成無色的菌落。將外源DNA片段克隆到Y(jié)AC中會導(dǎo)致該基因的插入失活，從而恢復(fù)紅色。因此，含有外源DNA片段的菌落呈紅色

? ? ? ? ?2.為有絲分裂穩(wěn)定性所必需的著絲粒序列的連接

? ? ? ? ?3.自主復(fù)制序列的連接(ARS)，為進行有絲分裂復(fù)制提供復(fù)制起點。這允許質(zhì)粒在染色體外復(fù)制，但使質(zhì)粒高度不穩(wěn)定，并容易失去著絲粒序列。

? ? ? ? 4.連接人工端粒序列，將環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為線狀DNA片段

? ? ? ? ?5.插入待擴增的DNA序列(最高1000kb)

? ? ? ? ?6.轉(zhuǎn)換酵母菌菌落

酵母染色體III

? ? ? ? 2014年3月，紐約大學(xué)(New York University)朗格尼醫(yī)學(xué)中心(Langone Medical Centre)的杰夫·博凱(jeff boke)發(fā)表論文稱，他的團隊合成了釀酒酵母16條酵母染色體中的一條，即染色體III，并將其命名為synIII。這個過程包括用合成的版本替換原始染色體中的基因，然后合成完成的染色體被整合到酵母細(xì)胞中。它需要設(shè)計和創(chuàng)造273871對DNA堿基對——比原始染色體中的316667對少。

基因工程應(yīng)用

? ? ? ? 酵母表達(dá)載體，如YACs、yps(酵母整合質(zhì)粒)和YEps(酵母外環(huán)質(zhì)粒)，與細(xì)菌人工染色體(BACs)相比具有優(yōu)勢，因為它們可以用于表達(dá)需要翻譯后修飾的真核蛋白。通過插入大的DNA片段，YACs可以被用來克隆和組裝一個有機體的整個基因組通過將YAC插入酵母細(xì)胞中，它們可以作為線性人工染色體繁殖，并在此過程中克隆插入的DNA區(qū)域。這一過程完成后，可以使用兩種方法來獲得已排序的基因組或感興趣的區(qū)域：

1.基因定位

2.染色體圖譜繪制

? ? ? ? 這是很重要的，因為它允許詳細(xì)地繪制基因組的特定區(qū)域。整個人類染色體已經(jīng)被檢測過，如X染色體。通過該技術(shù)，科學(xué)家標(biāo)記了許多遺傳疾病和性狀的遺傳標(biāo)記的位置。

人類基因組工程

? ? ? ?YACs明顯不如BAC穩(wěn)定，很容易產(chǎn)生“嵌合效應(yīng)”：克隆DNA的序列實際上不是對應(yīng)于單個基因組區(qū)域，而是對應(yīng)于多個基因組區(qū)域。嵌合作用可能是由于多個基因組片段結(jié)合到單個YAC中，也可能是兩個或多個YAC在同一宿主酵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)化后的重組嵌合的發(fā)生率可高達(dá)50%其他人為產(chǎn)物包括克隆區(qū)域片段的缺失和基因組片段的重排(如倒置)。在所有這些情況下，從YAC克隆中確定的序列與原始的自然序列不同，如果依賴克隆的信息，就會導(dǎo)致結(jié)果不一致和解釋錯誤。由于這些問題，人類基因組計劃最終放棄了YACs的使用，轉(zhuǎn)而使用細(xì)菌人工染色體(BAC)，因為BAC的突變發(fā)生率非常低。除了穩(wěn)定性問題，特別是相對頻繁發(fā)生的嵌合事件，YACs在生成覆蓋整個人類基因組的最小平鋪路徑時被證明是低效的。生成克隆庫非常耗時。此外，由于在選擇合適的克隆時依賴序列標(biāo)記位點(STS)作為參考點的本質(zhì)，存在很大的差距，需要進一步生成庫來跨越。正是這個額外的障礙促使項目轉(zhuǎn)而使用BACs的兩個因素：

? ? ? ? 1.BACs的生成速度要快得多，當(dāng)生成冗余的克隆庫時，這是必要的。

? ? ? ? 2.BACs允許使用STSs進行更密集的覆蓋，從而在硅膠中生成更完整、更有效的最小平鋪路徑。

? ? ? ?然而，這兩種方法都是可行的，正如秀麗隱桿線蟲(C. elegans)的基因組所證明的那樣。大部分基因組都是由BACs拼接而成，而空白部分則由YACs填充。

人工染色體全家福