2022年12月，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院陳小松教授、陳良萬(wàn)教授和福建醫(yī)科大學(xué)陳敬華教授在?Advanced Science?雜志上發(fā)表了臍帶華通膠來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（WJ-MSCs）的相關(guān)研究，該成果也被編輯遴選為同期?Frontispiece?封面文章。福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院整形外科與再生醫(yī)學(xué)科陳鵬弘博士后、唐詩(shī)婕碩士、李銘副主任醫(yī)師為第一作者。

本文通過(guò)單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)?WJ-MSCs 的特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析。該研究分析確定了 4 種 WJ-MSCs 亞群，即 proliferative_MSCs， niche-supporting_MSCs，metabolism-related_MSCs 和 biofunctional-type_MSCs，并進(jìn)一步展示了這些亞群的轉(zhuǎn)錄組特征、細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞發(fā)育軌跡。有趣的是，本研究中選擇的 biofunctional-type_MSCs（S100A9， CD29 和 CD142）在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的傷口修復(fù)性能。整合空間組學(xué)數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，S100A9+CD29+CD142+?亞群在臍帶的胎兒端富集，表明源自胎兒端的這個(gè)亞群有潛力發(fā)展成為一種傷口愈合治療劑?？偟膩?lái)說(shuō)，本研究全面描繪了 WJ-MSCs 的異質(zhì)性，并為未來(lái)開(kāi)發(fā)基于 WJ-MSCs 的藥物提供了必要的資源。

科學(xué)問(wèn)題

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的異質(zhì)性是臨床轉(zhuǎn)化可重復(fù)、可預(yù)測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)化治療方法的障礙，傳統(tǒng) WJ-MSCs 治療出現(xiàn)的不良臨床結(jié)果和低重復(fù)性可能是由 WJ-MSCs 高度異質(zhì)性導(dǎo)致的。此外，不同臍帶（UC）區(qū)域的細(xì)胞之間也存在功能差異，這表明 WJ-MSC 空間異質(zhì)性對(duì)臨床治療的也具有潛在重要性。因此，MSCs 的標(biāo)準(zhǔn)化和特定亞群的鑒定是促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化的研究重點(diǎn)。利用單細(xì)胞和空間技術(shù)探索 WJ-MSCs 異質(zhì)性將有助于建立準(zhǔn)確的 MSC 分型和制定優(yōu)勢(shì)功能亞群的篩選方案。

研究思路

1、構(gòu)建 WJ-MSC 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了了解不同代 WJ-MSCs 的細(xì)胞多樣性和轉(zhuǎn)錄特征，從 3 個(gè)人類 UCs 中分離出 WJ-MSCs 進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后從 P0 代和 P3 代收集細(xì)胞用于后續(xù)的 10x Genomics ?scRNA-seq。6 個(gè)樣本（huc_1P0、huc_1p3、huc 2P0、huc 2P3、huc_3P0 和 huc_3P3）總共得到 38125 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行下游分析。文章將所有細(xì)胞劃分為 13 個(gè)細(xì)胞群，并根據(jù)標(biāo)記基因表達(dá)情況鑒定出細(xì)胞類型，將其命名為"proliferative_MSC" （clusters 0, 2, 3, 7）、"niche-supporting MSC" （clusters 1, 4, 11）、"metabolism-related MSC" （clusters 5, 8, 12）、"biofunctional-type_MSC" （clusters 6, 9）。其中 Cluster 10 所占細(xì)胞比例較小，且與其他群缺乏功能相似性，因此從后續(xù)分析中刪除。文章進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光分析證實(shí)了四個(gè)亞群的存在。

2、WJ-MSc 亞群的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化分析

文章分別對(duì) P0?和 P3 樣本進(jìn)行了擬時(shí)間分析。結(jié)果表明細(xì)胞按照嚴(yán)格的時(shí)序發(fā)育。proliferative_MSCs 是軌跡的起點(diǎn)，并貫穿整個(gè)發(fā)育軌跡過(guò)程，而biofunctional-type_MSCs、 niche-supporting_MSCs和metabolism-related_MSCs 主要分布在終點(diǎn)。基因在時(shí)間軌跡上表現(xiàn)出兩種主要趨勢(shì)。其中包括逐漸上調(diào)的基因（模塊 2、4、6）和逐漸下調(diào)的基因（模塊 1、3、5）。COL3A1、FN1、FTH1、CoL1A1、DCN?和?MYL9?的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，在創(chuàng)面愈合、細(xì)胞-底物粘附、成纖維細(xì)胞增殖調(diào)控和氧水平反應(yīng)中富集，而表達(dá)減少的基因則參與蛋白泛素化調(diào)控、有絲分裂細(xì)胞周期相轉(zhuǎn)變、還有核分裂。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了 WJ-MSCs 在轉(zhuǎn)錄和發(fā)育上的異質(zhì)性，并揭示了 WJ-MSCs 亞群之間的密切關(guān)系。

3、細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步描述 WJ-MSC 亞群之間的相互作用，使用 CellPhone DB 推斷這些細(xì)胞之間的配體-受體相互作用。該分析顯示，niche-supporting_MSCs 是最活躍的配體發(fā)送者，這表明這些細(xì)胞可能是維持細(xì)胞亞群良好穩(wěn)態(tài)和功能特異性的基礎(chǔ)。這些配體-受體對(duì)可能與 ECM 重建、組織發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)、血管生成和細(xì)胞增殖有關(guān)。

4、SCENIC 調(diào)控因子分析

根據(jù)四個(gè) cluster 中代表性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式，可以區(qū)分 WJ-MSC 亞型的身份，例如，biofunctional-type_MSCs 中?TP53?和?ELK3?活性升高，metabolism-related_MSCs 中?SP4、NFYA、HOXB7?和?SP2?活性上調(diào)，niche-supporting_MSCs 中?MAF、NFATC4?和?KLF9?活性升高，proliferative_MSCs?中?E2F2、E2F8?和?MYBL1?表達(dá)升高。這些數(shù)據(jù)表明多種轉(zhuǎn)錄因子的組合調(diào)控了 WJ-MSC 的發(fā)育并控制細(xì)胞功能維持異質(zhì)性狀態(tài)，這加深了我們對(duì) WJ-MSc 功能異質(zhì)性及其調(diào)控基礎(chǔ)的理解。

5、揭示 WJ-MSc 亞型在 P3 和 P0 的不同轉(zhuǎn)錄特征

為了驗(yàn)證 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，文章還對(duì) P3 （n = 3）和 P0（n = 3）MSC 樣本進(jìn)行了 bulk RNA-seq 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 P3 和 P0?的 WJ-MSCs 中共篩選出 532 個(gè)上調(diào)基因和 695 個(gè)下調(diào)基因，表明 WJ- MSCs 在不同傳代的顯著異質(zhì)性。TOP2A?是?bulk RNA-seq?中的一個(gè)上調(diào)基因，在所有四個(gè)亞群中廣泛分布，表達(dá)量高，而?HIST1H4C?則沒(méi)有變化，主要在 proliferative_MSCs 中。相反，CXCL?基因在 bulk RNA-seq 中表達(dá)下調(diào)，而在 niche-supporting_MSCs 中表達(dá)高。以上發(fā)現(xiàn)綜合反映了 WJ-MSCs 細(xì)胞多樣性和分子復(fù)雜性。

P3 和 P0 之間四種細(xì)胞類型的獨(dú)特基因模式，使用基因集富集分析（GSEA）對(duì)差異進(jìn)行全面研究。結(jié)果顯示，proliferative_MSCs 具有與神經(jīng)折疊形成相關(guān)的基因表達(dá)，niche-supporting_MSCs 優(yōu)先參與有絲分裂姐妹染色粒分離，metabolism-related_MSCs 富集于線粒體翻譯終止，biofunctional-type_MSCs 與維持端粒相關(guān)。此外，還探究了各亞群體中 P3 和 P0之 間的差異表達(dá)基因（DEGs）是否也受到獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

6、proliferative_MSCs 的異質(zhì)性參與調(diào)控增殖活性

proliferative_MSCs 在 WJ-MSCs 中所占比例最大，除了其增殖潛力外，還確定了其他特定功能。Top 基因富集于與女性生殖發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和一氧化氮生物合成過(guò)程相關(guān)的通路。文章接下來(lái)探討了 proliferative_MSCs（cluster 0、2、3和7）的異質(zhì)性。其中，cluster 0 參與細(xì)胞周期過(guò)程，cluster 2 與染色體分離調(diào)控相關(guān)，DNA 復(fù)制顯著富集在 cluster 3 中，cluster 7 涉及蛋白質(zhì)異三聚化、氧轉(zhuǎn)運(yùn)和對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 的響應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，proliferative_MSCs 是高度異質(zhì)性的，由多個(gè)功能不同的細(xì)胞亞群組成。隨后，通過(guò)擬時(shí)間分析探索其發(fā)展軌跡?？偟膩?lái)說(shuō)，動(dòng)態(tài)基因表達(dá)模式反映了它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用。

7、niche-supporting_MSCs? 3 個(gè)亞群分析

niche-supporting_MSCs 分為三種不同類型子細(xì)胞群，胞吞和衰老的調(diào)控富集在 cluster 1，提示 cluster 1 可能介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。cluster 4 中?DCN、COL3A1、COL14A1、LUM?表達(dá)富集，這些因素與膠原纖維組織、ECM 組織和組織重塑有關(guān)，這意味著為細(xì)胞發(fā)育提供了結(jié)構(gòu)支持。cluster 11 顯示富集的基因涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育和活性氧代謝過(guò)程的正向調(diào)控。
接下來(lái)，檢測(cè)?niche-supporting_MSCs?在 P3 和 P0 之間的差異。來(lái)自 P0 的 niche-supporting_MSCs 可能部分繼承了 WJ 組織富含膠原蛋白的特性，而來(lái)自 P3 的 niche-supporting_MSCs 符合培養(yǎng)的 MSCs 的高增殖特征。文章進(jìn)一步構(gòu)建了這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄軌跡，結(jié)果清楚地表明 P0 細(xì)胞沿各軌跡分布。相反，P3 細(xì)胞則集中在軌跡的左側(cè)，這可能反映了在體外擴(kuò)增過(guò)程中，niche-supporting_MSCs 亞群發(fā)生轉(zhuǎn)化的不同階段。分析結(jié)果顯示 6 個(gè)基因模塊，揭示了來(lái)自不同傳代的 niche-supporting_MSCs 的不同細(xì)胞過(guò)程和功能轉(zhuǎn)變。

8、biofunctional-type_MSCs 參與傷口愈合響應(yīng)

結(jié)合單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析和功能富集，發(fā)現(xiàn) biofunctional-type_MSCs 是具有免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)功能的主要功能亞群，高表達(dá)各種免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)相關(guān)基因。
biofunctional-type_MSCs 分成了兩種不同的 cluster（cluster 6 和 9）。cluster 9 中趨化因子水平增加，如?CXCL16、CXCL5、CXCL2?和?CXCL3，揭示了免疫調(diào)節(jié)治療特性。功能富集分析也揭示了兩個(gè)亞型之間不同的功能特征。此外，該亞群的 DEGs （P3 vs P0）主要參與血管生成。根據(jù)單細(xì)胞數(shù)據(jù)將?CD142、CD29?和?S100A9?確定為該亞群體的候選標(biāo)記基因，用于后續(xù)分選實(shí)驗(yàn)。在體外實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中，S100A9+CD29+CD142+?細(xì)胞可以增強(qiáng)創(chuàng)面愈合相關(guān)細(xì)胞增殖能力及遷移能力。在斑馬魚(yú)皮膚傷口模型中，S100A9+CD29+CD142+?比“傳統(tǒng)” WJ-MSCs 更能促進(jìn)傷口愈合。這些數(shù)據(jù)也反映了 S100A9+CD29+CD142+?可作為未來(lái)用于傷口修復(fù)的主要功能亞群。

9、WJ 區(qū)域異質(zhì)性的空間比對(duì)

人臍帶可分為三個(gè)區(qū)域：羊膜下區(qū)、WJ 區(qū)和血管周圍區(qū)。不同功能的間充質(zhì)干細(xì)胞可能存在于膠質(zhì)性 WJ 的不同部位。為此，使用來(lái)自同一臍帶不同部分的四個(gè)切片（huc_2 和 huc 3）進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組分析（ST）：huc 2-maternal segment，huc_2-fetal segment，huc_3-maternal segment 和 huc_3-fetal segment。根據(jù) 4 個(gè)樣本切片的聚類特異性標(biāo)記基因，確定了定位于血管間隙的 WJ 源性肌成纖維細(xì)胞（WMF），由COL4A2?和?MYL6?標(biāo)記；上皮細(xì)胞（KRT13、KRT5?和?KRT17）、內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1、CD34、VWF?和?CDH5）和紅細(xì)胞（HBA2、HBG2、HBA2?和?HBB）也被鑒定出來(lái)。DEG 結(jié)果顯示，母體端和胎兒端存在不同的轉(zhuǎn)錄特征，母體端在 ECM 組織、細(xì)胞連接組織、粘附和 ECM 受體相互作用方面均有明顯富集。相比之下，胎兒端富含與皮膚發(fā)育、表皮發(fā)育和參與免疫反應(yīng)和血管生成調(diào)節(jié)的中性粒細(xì)胞激活相關(guān)的基因集，這表明該端是皮膚傷口愈合的關(guān)鍵 MSC 來(lái)源。

10、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析

接下來(lái)，文章使用 SPOTlight 關(guān)聯(lián)單細(xì)胞和空間數(shù)據(jù)集，以確定組織每個(gè) spot 內(nèi)每種細(xì)胞類型的百分比，并使用餅圖進(jìn)行可視化。結(jié)果表明，biofunctional-type_MSCs 亞群在胎兒端的比例高于母體端。此外，通過(guò)細(xì)胞類型之間的空間相互作用分析，探索兩種不同細(xì)胞類型在同一 spot 出現(xiàn)的頻率。來(lái)自同一供體的不同 UC 區(qū)域的細(xì)胞類型相互作用不同，同一 UC 區(qū)域在不同供體之間也存在不同的相互作用關(guān)系，體現(xiàn)了細(xì)胞的空間異質(zhì)性?？偟膩?lái)說(shuō)，結(jié)合 scRNA-seq 和 ST 分析揭示的細(xì)胞亞群的功能和空間分布之間的關(guān)系，對(duì)臨床轉(zhuǎn)化也有潛在的影響。

研究結(jié)論

總的來(lái)說(shuō)，本研究繪制了第一個(gè)全面的 WJ-MSCs 大規(guī)?？臻g和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，以破譯 WJ-MSCs 的異質(zhì)性，并從多角度闡明它們的結(jié)構(gòu)。將間充質(zhì)干細(xì)胞的分子特征與其功能聯(lián)系起來(lái)是極具挑戰(zhàn)性的。文章中的數(shù)據(jù)將成為未來(lái)類似研究的重要資源。值得注意的是，文章還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有傷口修復(fù)能力的關(guān)鍵 WJ-MSC 亞群，并提示該亞群來(lái)自 UC 的胎兒段，可能具有理想的治療效能。因此，這項(xiàng)研究提高了 WJ-MSC 亞群體作為資源的價(jià)值，促進(jìn)了新的治療策略的發(fā)展。這一信息對(duì)臨床轉(zhuǎn)化和藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。