隨著蛋白組學的深入研究，抗體標記技術也被廣泛用于醫(yī)學病理學、免疫組織化學、分子生物學、生物制藥等領域，但很多科研人員在選擇多種標記的抗體時遇到困難，那么今天我們一起了解這四種常用的抗體標記方法，這些方法平時都用對了嗎？

什么是抗體標記？

抗體標記是指將標記物（酶，熒光素，生物素等）共價連接到抗體上，與待檢測物（如某些特定抗原）特異性反應形成多元復合物，并借助于儀器對試驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定，以用于對抗原、抗體反應進行定性和定位研究或進行定性和定量測定。
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熒光色素標記抗體

這種標記方法是將熒光素與相應的抗體(或抗原)結(jié)合，將熒光標記的抗體(或抗原)與標本中相應的抗原形成熒光標記的抗體-抗原復合物，用熒光顯微鏡觀察。在顯微鏡若存在熒光則意味著存在抗原抗體復合物，因此可根據(jù)已知的抗體(或抗原)推斷出另一種未知抗原(或抗體)的存在。

操作步驟

1.用于分離標記抗體和游離的熒光色素準備好凝膠濾柱。使用消除分離球形蛋白的極限?20 000?～?50 000?凝膠介質(zhì)和細粒凝膠(直徑約?50 um）。所需凝膠濾柱的尺寸可根據(jù)偶聯(lián)反應的總體積進行× 20?來確定。按廠家說明準備濾柱，用?20?雙柱床體積?PBS?注入濾柱，直到緩沖液水平剛剛降低到柱床頂部，關閉濾紙底部的閥門或使用塑料粘土(或?parafilm?）封閉底部，使濾柱不再流動。

2.用0.1mol/L?硼酸鈉或碳酸鈉的制備濃度至少為?2mg/ml?的抗體溶液（pH9.0）。含一級胺的外來分子應避免引入。

3.用無水DMSO?溶解(優(yōu)級純) FITC或TRITC至1mg/ml。每次標記反應時需即時配置。

4.每?1ml?蛋白溶液加50ul染液，每次都要5ul?慢慢加入，加入時應輕輕連續(xù)攪拌。

置4℃避光反應1h?。

5.加氯化銨至50mmol/L，室溫孵育2h。加入0.1 %二甲苯氰和5％甘油。

6.通過凝膠過濾分離結(jié)合物與未結(jié)合的染料。小心地將偶聯(lián)反應產(chǎn)物加在濾柱頂部，打開閥門使抗體溶液流過濾柱直至剛好進入柱床。再小心地將?PBS 加在濾柱頂部并與緩沖液供應裝置連接。結(jié)合染料的抗體首先洗脫，通?？稍谑夜庀乱姷健?/p>

7.將洗脫液的結(jié)合物4℃貯存于避光容器，必要時加入 0.02％疊氮鈉。

8.進行熒光素偶聯(lián)反應時，應通過測量495nm和280nm 波長的吸光值計算熒光素和蛋白的比率，羅丹明的測量波長在 550nm 和 280nm 。熒光素的吸光值比例（ 496nm/280nm ）應在 0.3 ～ 1.0 之間，羅丹明的吸光值比率（ 550nm/280nm ）在 0.3 ～ 0.7 之間。低于上述比率將導致低信號，高比率則出現(xiàn)高背景。若比率太低，應使用低濃度抗體與高濃度染料重復結(jié)合；若比率太高，則可適當調(diào)整后重新標記，或通過 DEAE 離子交換層析柱進一步純化抗體。用 10mmol/L 磷酸鉀（ pH8.0 ）平衡并灌注濾柱，通過增加鹽濃度進行梯度洗脫。測量每一組分的吸光值比率（ 495/280 或 550/280 ），選取適當組分合并。

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生物素標記抗體

抗體標記中生物素的引入使整個過程靈敏度大大提高！這種方法可使抗體或其它蛋白質(zhì)的ε-氨基與?；纳锼毓矁r結(jié)合，生物素化的分子可以通過酶標記的抗生物素蛋白或熒光染料-鏈霉抗生物素蛋白復合物來檢測。小分子水溶性生物素對鏈霉親和素的高親和力是該方法的設計基礎。

操作步驟

1.用無水?DMSO?配制?10mg/ml?生物素?N-?羥基琥珀酰亞胺酯溶液。

2.硼酸鹽緩沖液（0.1mol/L, pH8.8?）配制濃度至少為1?～3mg/ml?如果在抗體儲存過程中添加疊氮鈉，則必須在硼酸鹽緩沖液中充分透析去除疊氮鈉。

3.按25～100μg/mg將生物素酯加入抗體，在室溫下均勻混合孵化4h。在完成組合反應之前DMSO最終濃度不得低于5 %，否則生物素酯會沉淀。高濃度的生物素酯會導致體上結(jié)合多個生物素分子，因此所有抗體都可能被標記。較低的比例將使生物素化保持在最低限度（25μg生物素酯/mg摩爾比最初是抗體10:1）。

4.每250μg添加生物素酯20μl1mol/L氯化銨，室溫孵化10min?。

5.使用抗體溶液PBS?或其他緩沖液透析，以去除未結(jié)合的生物素。由于生物素分子較大，透析比預期的要慢，或使用蛋白質(zhì)A或蛋白G層析柱再次純化抗體。

6.標記抗體按純化抗體的儲存方法保存。

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放射性碘標記抗體

蛋白質(zhì)的碘標記方法有很多種，比如我們常用的化學法或酶促法通過氧化對蛋白質(zhì)分子進行碘化等。

操作步驟

1.在碘標記前，準備氯甘脲包試管（2支6mm堿性玻璃管或1.5ml錐形試管)。氯甘脲溶于濃度0.5μg/ml的氯仿中。然后將其分別加入試管管100μl和20μl。讓氯仿在通風柜中揮發(fā)過夜。在干燥器中儲存室溫試管，可保存數(shù)年。包被有20μl氯甘脲試管碘化效率低。如果抗體在正常碘化反應中受損，可以使用。

2.準備分離標記抗體的凝膠層分析柱，體的凝膠層分析柱。排阻限制為20000～50000凝膠介質(zhì)用于分離球形蛋白分子。選擇中等粒度的凝膠微柱(直徑約100μm）。按說明書準備裝備1ml標記后，體積凝膠微柱的濾柱將被丟棄，因此應選擇合適的濾柱。為了最大限度地減少碘化蛋白的非特異性組合，濾紙應至少先使用10倍體積的含0.02％疊氮鈉的1％BSA/PBS然后再用10倍體積的PBS去除淋洗濾柱BSA。或者用含BSA使用前沖洗緩沖液膨脹凝膠顆粒BSA。讓濾柱內(nèi)的緩沖液流出，直到剛好低于柱床頂部，關閉凝膠柱底部的閥門，或用塑料粘土堵塞膠柱末端。

3.碘化反應前應立即準備終止管，用于終止氧化反應，保留未參與結(jié)合反應的剩余碘。1.5ml加入錐形試管50μl氯甘脲終止緩沖液

4.室溫下，在通風柜內(nèi)加入氯甘脲袋50μl抗體0.5mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）配制，濃度為0.2～1mg/ml。

5.添加抗體氯甘脲試管500μCiNa，把吸液頭扔進去放棄125I容器中的材料2min，時間可以稍微延長，但可能會增加抗體的氧化損傷。

6.用巴斯德移液管移動試管中的液體50μl輕輕混合氯甘脲終止緩沖液的試管。將巴斯德移液管和氯甘脲包放入放射性廢物容器中。

7.小心將終止管中的反應混合物添加到濾柱中，并將移液管丟入放射性廢物容器中。

8.放開濾柱閥門，開始收集洗脫液1.5ml錐形試管。碘標記蛋白流入凝膠微珠后，小心添加到濾柱中0.3ml含0.02％疊氮鈉PBS。在第一管中繼續(xù)收集洗脫液。當緩沖液到達凝膠微珠頂部時，用第二個錐形試管替換，然后加入濾柱0.3ml含0.02％疊氮鈉的PBS，再收集洗脫液。繼續(xù)重復上述洗脫步驟。微型檢測儀用于監(jiān)測各種管道125I標記抗體和游離標記物的峰值?？贵w應出現(xiàn)在第一位2～4洗脫成分明顯早于藍色二甲苯藍氰醇，后者與游離標記物一起洗脫。

9.合并含碘化抗體的洗脫組分。將未參與反應的標記物和整個過濾柱與放射性廢物容器一起丟失。

10.可儲存標記抗體1％PBS/BSA放入洗脫緩沖液中4℃保存?？贵w雖然穩(wěn)定，但放射性碘不穩(wěn)定。因此，應標記抗體6周內(nèi)使用。

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生物合成法標記單克隆抗體

操作步驟

1.雜交瘤細胞在標記時必須生長旺盛，快速增殖。離心（3000?轉(zhuǎn)/10min）收集大約2×106個細胞。

2.用37℃不含蛋氨酸的培養(yǎng)基重懸細胞，洗一次，然后離心300g，10min。

3.不含蛋氨酸的培養(yǎng)基重懸細胞至約106/ml。加入[35S]蛋氨酸(每次標記100μCi）可獲得的放射性強度約為105～106cpm的抗體。

4.于CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育過夜

5.懸液細胞1000g離心10min，獲得密集的細胞沉淀。放棄上清液。1/20體積的1mol/LTris(pH8.0)和疊氮鈉至0.02％。
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關于普健

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普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作為武漢國家生物產(chǎn)業(yè)基地公共服務平臺—光谷抗體發(fā)現(xiàn)與篩選公共服務平臺。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白、抗體、診斷原料、抗體藥物發(fā)現(xiàn)等自主技術平臺的建設和下游生物醫(yī)藥產(chǎn)品的戰(zhàn)略合作。經(jīng)過10年的發(fā)展，普健生物已成為一家立足武漢，業(yè)務覆蓋全國、輻射全球的高新技術服務企業(yè)。目前公司擁有4200平米自建實驗室（包含800平高標準BSL-2級細胞房），擁有齊全蛋白抗體開發(fā)設備500余套，包括高通量蛋白純化儀、Agilent?流式細胞分析儀，全自動HPLC分析儀，openSPR蛋白、抗體親和力測定儀，Olympus熒光顯微鏡，?BTX電融合儀，2*7L微生物發(fā)酵罐，中試型高壓均質(zhì)機，全自動管式化學發(fā)光儀，以及配套的高速離心機，細胞計數(shù)儀及大容量細胞培養(yǎng)搖床。公司先后獲得榮譽：3551人才計劃、高新技術企業(yè)、技術先進型服務企業(yè)、光谷瞪羚企業(yè)。
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