盡管FITC仍然是制備綠色熒光生物復(fù)合物zui常用的熒光標(biāo)記染料，但是FITC也存在一定的局限性，如顯微鏡成像的嚴(yán)重光漂白和pH敏感熒光。用iFluor制備蛋白質(zhì)結(jié)合物??488染料遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于熒光素衍生物的共軛物，如FITC。iFluor 488共軛物明顯比熒光素共軛物更亮，并且更容易光照。

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另外，iFluor的熒光??488不受pH（4-10）的影響。這種pH不敏感是對(duì)熒光素的一個(gè)重大改進(jìn)，熒光素只有在pH高于9時(shí)才會(huì)發(fā)出zui大的熒光??488se染料穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)氨基具有良好的反應(yīng)性和選擇性。這個(gè)iFluor??488具有與Alexa Fluor?488 NHS酯類(lèi)似的光譜性質(zhì)和反應(yīng)活性（Alexa Fluor?是Invitrogen的商標(biāo)）。

一、儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性等份，并在制備后在-20°C下儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

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1.蛋白質(zhì)原液（溶液A）

將100μL反應(yīng)緩沖液（例如，1 M碳酸鈉溶液或pH~9.0的1 M磷酸鹽緩沖液）與900μL目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如，抗體，蛋白質(zhì)濃度>2 mg/mL，如果可能）混合，得到1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備溶液。

注：

1）蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH值低于8.0，則使用1 M碳酸氫鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調(diào)節(jié)至8.0-9.0。

2）蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，pH值為7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須針對(duì)1X PBS（pH 7.2-7.4）進(jìn)行透析，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和醋酸銨）。

3）不純抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體將不能很好地標(biāo)記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾共軛反應(yīng)。疊氮化鈉或硫柳汞可通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱去除，以獲得zui佳的標(biāo)記結(jié)果。

4）如果蛋白質(zhì)濃度小于2 mg/mL，則接合效率會(huì)顯著降低。為獲得zui佳標(biāo)記效率，建議zui終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg/mL。

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2.熒光燈??488硒儲(chǔ)備液（溶液B）

將無(wú)水二甲基亞砜加入iFluor瓶中??350 SE制成10 mM儲(chǔ)備溶液。用移液管或旋渦攪拌均勻。

注：開(kāi)始接合前，制備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）。及時(shí)使用。染料原液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料的活性。溶液B在避光防潮的情況下，可在冰箱中保存兩周。避免凍融循環(huán)。

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二、樣本實(shí)驗(yàn)方案

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該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗鼠IgG與iFluor的結(jié)合物而建立的??350東南。你可能需要進(jìn)一步優(yōu)化你的特定蛋白質(zhì)。

注：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比率，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記會(huì)有害地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)結(jié)合物會(huì)降低靈敏度。

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運(yùn)行共軛反應(yīng)

1.以溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比為10:1為起點(diǎn)：將5μL染料儲(chǔ)備液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備液為10 mM）加入蛋白溶液（95μL溶液A）小瓶中，有效搖勻。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL且蛋白質(zhì)的分子量為200KD，則蛋白質(zhì)的濃度約為0.05mm。

注：我們建議使用10:1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。如果太少或太高，確定zui佳染料/蛋白質(zhì)比分別為5:1、15:1和20:1。

2.在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

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純化結(jié)合物

1.以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物的實(shí)例。

2.按照生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)制備葡聚糖凝膠G-25柱。

3.將反應(yīng)混合物（從“運(yùn)行共軛反應(yīng)”）裝入Sephadex G-25柱頂部。

4.一旦樣品剛好在樹(shù)脂頂面以下，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

向所需樣品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱純化。合并含有所需染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物的部分。

注：

1）為了立即使用，染色蛋白結(jié)合物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

2）為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

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三、示例數(shù)據(jù)分析和圖表

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表征所需的染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物

取代度（DOS）是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui重要因素。DOS較低的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但DOS較高的蛋白質(zhì)（如DOS>6）也傾向于降低熒光強(qiáng)度。大多數(shù)抗體的zui佳DOS推薦在2到10之間，這取決于染料和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。為了有效的標(biāo)記，取代度應(yīng)控制在6-8摩爾iFluor??350硒相當(dāng)于一摩爾抗體。以下步驟用于確定iFluor的DOS??350硒標(biāo)記蛋白。

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測(cè)量吸收率

為了測(cè)量染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物的吸收光譜，建議根據(jù)染料的消光系數(shù)將樣品濃度保持在1-10μM的范圍內(nèi)。

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讀取280 nm處的OD（吸光度）和染料zui大吸收（對(duì)于iFluor，?max=450 nm）??350種染料）

對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，樣品（來(lái)自色譜柱部分）需要用去離子水稀釋，以便OD值在0.1到0.9的范圍內(nèi)。280nm處的吸光度是蛋白質(zhì)的zui大吸收，450nm是熒光的zui大吸收??350東南。為了獲得準(zhǔn)確的DOS，確保共軛物中沒(méi)有非共軛染料。

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計(jì)算DOS

Figure 1.HeLa細(xì)胞與（微管蛋白+）或不與（微管蛋白-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后用iFluor??488山羊抗鼠IgG結(jié)合物（綠色，左側(cè)）或Alexa Fluor?488山羊抗鼠IgG結(jié)合物（綠色，右側(cè)）。細(xì)胞核用hoechst33342（藍(lán)色）染色。

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美國(guó)AAT Bioquest Inc。（前身是ABD Bioquest，Inc。）是一家為從事生命科學(xué)研究、診斷研發(fā)及藥物開(kāi)發(fā)的科學(xué)家研發(fā)、生產(chǎn)和銷(xiāo)售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，包括顯色、熒光和生物發(fā)光技術(shù)。AAT Bioquest的產(chǎn)品幫助全世界的科學(xué)家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域。作為AAT Bioquest Inc。的中國(guó)區(qū)域代理，艾美捷科技為中國(guó)客戶提供光譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)并應(yīng)用于生化、生理代謝和細(xì)胞分析領(lǐng)域的產(chǎn)品，包括顯色，熒光和發(fā)光技術(shù)等全系列解決方案。