上一期我們談到了最簡單的RNAi——Accell siRNA，也介紹了產(chǎn)品的一些基本屬性，很多家人們對Accell?siRNA充滿了興趣，想進(jìn)一步了解Accell?siRNA的實際應(yīng)用情況。

這不，本期優(yōu)寧維分子君帶著應(yīng)用文獻(xiàn)“Buff”加持來咯，全方面展示 Accell?siRNA的多功能應(yīng)用情況。

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in vitro——難轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)用

背景：Spry2和PTEN是公認(rèn)的受體酪氨酸激酶 (RTK) 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，Spry2 或 PTEN 的敲低可增強背根神經(jīng)節(jié) (DRG) 神經(jīng)元的軸突再生。為了比較同時敲低Spry2和PTEN或單一敲低其中之一的促軸突伸長作用效果，作者使用了PTEN- Accell siRNA進(jìn)行體外DRG（Spry2-/-?；Spry2+/-?）的雙敲低驗證。

方法：

1）?DRG神經(jīng)元的分離培養(yǎng)：選取野生型小鼠，純合型Spry2-/-、雜合型Spry2+/-基因敲除小鼠，分離相應(yīng)的DRG，經(jīng)洗滌和機械分離形成神經(jīng)節(jié)，最終通過離心重懸形成原代神經(jīng)細(xì)胞；

2）?原代神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：

a.?選用Accell siRNA進(jìn)行對照組（Accell non-targeting siRNA pool）和實驗組（Accell mouse PTEN SMARTpool siRNA mixture）的轉(zhuǎn)染;

b.?原代神經(jīng)細(xì)胞貼壁生長2h后，使用終濃度為1uM的Accell siRNA搭配使用Accell siRNA delivery media進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

c.?分別在轉(zhuǎn)染24h, 48h, 72h后進(jìn)行檢測；

3）?qPCR、免疫組化、軸突生長分析、WB驗證等。

結(jié)果：Accell siRNA無需轉(zhuǎn)染試劑的遞送系統(tǒng)，更適合于原代神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染優(yōu)化，一定程度上更好地敲低PTEN。結(jié)果也表明，較單一敲低PTEN，同時敲低Spry2和PTEN在軸突伸長中有更強的影響力，聯(lián)合治療方法可能更有助于改善神經(jīng)再生。

ex vivo——活體外肺切片應(yīng)用

背景：特發(fā)性肺纖維化 (IPF) 是一種慢性疾病，為了找到合適的藥物靶點，作者使用Accell siRNA沉默活體外肺切片中Serpinh1基因編碼的熱激蛋白47（HSP47），從而評估Serpinh1基因作為藥物靶點的可能性。

方法：

1）?活體外肺切片的制備與培養(yǎng)：每個Slice重4~5mg，厚度為250~350um，直徑為5mm；每個切片單獨置于12孔板中，每48h更換培養(yǎng)基；

2）?增強肺切片的纖維發(fā)生：在培養(yǎng)基中添加5ng/mL TGFβ1；

3）?Accell siRNA沉默：分別使用終濃度為0.5uM的Serpinh1-targeting Accell siRNA和對照Accell siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

4）?mRNA水平表達(dá)量檢測：作用96h后，提取RNA進(jìn)行qPCR的檢測；

5）?蛋白水平表達(dá)量檢測：作用144h后，進(jìn)行WB驗證。

結(jié)果：Accell siRNA轉(zhuǎn)染后，Serpinh1基因mRNA表達(dá)量下降了65%，HSP47蛋白表達(dá)量下降了90%，該過程并未影響肺切片的活力和形態(tài)。且沉默Serpinh1基因后，只觀察到纖維連接蛋白分泌量減少，其他纖維生成不受影響。這表明Serpinh1-targeting Accell siRNA有效的抑制了小鼠的肺纖維化，增加了Serpinh1基因作為藥物靶點的可能性。

in vivo——活體內(nèi)角膜基質(zhì)注射應(yīng)用

背景：這篇文章中Accell siRNA作為一個前期驗證，為作者下游實驗奠定基礎(chǔ)。角膜營養(yǎng)不良作為染色體顯型疾病，非常適合使用小干擾 RNA (siRNA) 進(jìn)行等位基因特異性基因沉默。通過注射遞送至角膜的 siRNA 雖然有效，但不適合頻繁的長期治療方案。作者為了驗證他們創(chuàng)新性的局部應(yīng)用替代方案，首先使用Accell siRNA分別進(jìn)行角膜基質(zhì)的遞送和局部表面應(yīng)用的對比。

方法：

1）?角膜基質(zhì)內(nèi)注射Accell siRNA：分別使用Accell control (Accell-NSC4)?，luc2?siRNAs (Accell-siLuc)?進(jìn)行小鼠角膜基質(zhì)內(nèi)注射（每只小鼠每個眼睛角膜基質(zhì)內(nèi)注射量：150pmol/ul,?2ul），利用小動物活體成像儀觀察角膜上皮熒光素酶表達(dá)情況，觀察時間為7天；

2）?局部表面應(yīng)用Accell siRNA：方法同上。

結(jié)果：角膜基質(zhì)內(nèi)注射Accell siRNA能夠有效地抑制體內(nèi)熒光素酶的表達(dá)，且在72h后達(dá)到大于50%的沉默效果，在第5天可以達(dá)到最高沉默效果（64%），且總的沉默效果可持續(xù)6天。與之相反，局部表面應(yīng)用Accell?siRNA，熒光素酶表達(dá)沒有顯著下降，基本沒有被敲低。因此，憑借這個結(jié)果，作者認(rèn)為siRNA在小鼠眼部局部給藥應(yīng)用中存在局限，為了找到更好的局部給藥方式，作者展開了一系列的實驗驗證。Accell?siRNA在這篇文獻(xiàn)中起關(guān)鍵性引導(dǎo)作用。

講座預(yù)告：

軟文篇幅有限，分子君僅挑選了幾篇代表性的文章進(jìn)行展示，其實Accell?siRNA的應(yīng)用遠(yuǎn)不局限于此，感興趣的小伙伴們可持續(xù)鎖定優(yōu)寧維小優(yōu)博士：1月25日下午4點Accell siRNA應(yīng)用專題講座，屆時我們可以一起線上探討Accell siRNA的產(chǎn)品性能、使用方式等，更多Accell?siRNA延伸應(yīng)用，敬請期待~！

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