「青蓮聚焦」磷酸化+乙?；揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)揭示番紅花在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的抗癌作用
一些研究表明，番紅花提取物及其成分對不同的惡性細(xì)胞具有抗腫瘤活性和化學(xué)預(yù)防作用。然而，番紅花誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的分子機制尚不明確。磷酸化在大多數(shù)細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和基因表達(dá)，并調(diào)節(jié)大多數(shù)細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。此外，賴氨酸乙酰化是另一種?PTM，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，代謝過程的調(diào)節(jié)和細(xì)胞功能。因此，對這些修飾模式的改變的全面研究將提高對番紅花處理誘導(dǎo)MDA-MB-23細(xì)胞凋亡的潛在機制的理解。
2022年09月29日，在Journal of Proteome Research (IF 5.37)?雜志上最新發(fā)表了題為“Quantitative Phosphoproteomics and Acetylomics of Safranal Anticancer Effects in Triple-Negative Breast Cancer Cells”的研究論文。該研究通過TMT標(biāo)記方法對番紅花處理的MDA-MB-231細(xì)胞進行了全面的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和乙?；鞍踪|(zhì)組學(xué)分析，揭示了番紅花誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡的潛在機制。
研究背景
番紅花來自鳶尾科，俗稱藏紅花，主要在中東和亞洲地區(qū)種植，傳統(tǒng)上被用作食物的香料和治療焦慮、抗痙攣、鎮(zhèn)靜和心血管疾病的草藥。藏紅花中的生物活性物質(zhì)主要包括:?藏紅花醛、藏紅花素、藏花酸和苦番紅花素，它們對藏紅花的香氣、色澤和風(fēng)味起重要作用。藏紅花的香氣是由苦番紅花素的熱分解產(chǎn)生的，具有許多生化特性，如緩解心肌缺血?再灌注損傷，抗結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)肺癌、前列腺癌、和乳腺癌細(xì)胞株的凋亡。然而，其作用的潛在分子機制尚不清楚。
研究重點
藏紅花醛是藏紅花中的一種細(xì)胞毒性化合物，可使得三陰性乳腺癌細(xì)胞死亡。最近的研究報道了番紅花的抗癌作用，進一步證明了它對蛋白質(zhì)翻譯、線粒體功能障礙和DNA片段化的影響。為了更好地了解潛在機制，該研究通過結(jié)合TMT標(biāo)記和富集方法（包括二氧化鈦和免疫沉淀）對藏紅花處理的MDA-MB-231細(xì)胞進行了全面的磷酸化和乙?；鞍踪|(zhì)組學(xué)分析。揭示了不同信號通路中廣泛的磷酸蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)，這些信號通路被藏紅花醛處理破壞。藏紅花醛影響DNA復(fù)制和修復(fù)、翻譯和EGFR激活/積聚的蛋白質(zhì)的磷酸化水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，藏紅花醛通過H4的低乙?；柚剐迯?fù)，并通過H3的高乙?；龠M促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，從而將細(xì)胞推向死亡邊緣。
樣本策略
番紅花處理的MDA-MB-231細(xì)胞，分別在30min、12h、24h三個不同時間點收集，每個時間點重復(fù)三次。此外，以含0.15%?二甲基亞砜的細(xì)胞培養(yǎng)基作為對照，兩次重復(fù)培養(yǎng)12h。
研究思路
研究結(jié)果
番紅花誘導(dǎo)的MDA-MB-23細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組研究進展
共鑒定到4,409個蛋白，14,809個肽以及18,781個磷酸化修飾位點。大多數(shù)鑒定的磷酸化修飾發(fā)生在絲氨酸（86.5%）上，其次是蘇氨酸（13%）和酪氨酸（0.5%?，圖1A）。與長期刺激效應(yīng)相比，在時間點30分鐘的番紅花刺激時鑒定的磷酸肽遠(yuǎn)離其他兩個時間點分組，最有可能說明對細(xì)胞的即時番紅花刺激效應(yīng)（圖1B）。使用k-Means將所有磷酸肽聚集在六個不同的簇中，并通過t-SNE進行可視化（圖1C）?；贔C＞2倍且?B-H校正p值< 0.05和變異系數(shù)(CV%)≤30%的肽被認(rèn)為是顯著差異的磷酸肽。和對照組相比，分別在番紅花刺激30min，12和24h后篩選到1,044（812上調(diào)和232下調(diào)），3,729（2,607上調(diào)和1,122下調(diào)）和4,844（2,981上調(diào)和1,863下調(diào)）個磷酸肽。大多數(shù)磷酸化位點在番紅花處理后上調(diào)，表明番紅花誘導(dǎo)了大量激酶的產(chǎn)生或抑制了磷酸酶的活性。
番紅花通過EGFR信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和死亡
乳腺癌治療的主要靶點是表皮生長因子受體（EGFR）和ErbB受體酪氨酸激酶家族的其他相關(guān)受體。這些受體調(diào)節(jié)幾個重要生物過程，包括增殖、分化、生存或死亡，特別是在癌細(xì)胞中。在EGFR和其他ErbB信號模塊的下游有三條重要的信號通路，包括磷脂酰肌醇3激酶/Akt(PKB)通路、Ras/Raf/MEK/ERK1/2通路和磷脂酶C(PLCγ)通路。這些通路在該研究中被發(fā)現(xiàn)在番紅花處理的30min后受到高度調(diào)控。此外，IPA富集分析證明了腹腔注射30min后，erbB信號(3.606 z-score)、乳腺癌HER-2信號(3.13 z-score)、mTOR信號(3 z-score)和表皮生長因子信號(2.111 z-score)均被激活。
作為EGFR激活劑的主要自體磷酸化位點Tyr-1197的磷酸化在番紅花處理30min后上調(diào)1.5倍，在刺激12h后增加到3.4倍。過度激活的EGFR導(dǎo)致受體進一步內(nèi)化、積累和細(xì)胞凋亡。除了Tyr-1197的磷酸化，在番紅花處理后，Tyr-869的磷酸化也被上調(diào)。Tyr-869位于催化區(qū)，由非受體酪氨酸激酶Src介導(dǎo)。Src對Tyr-869殘基的磷酸化是對EGFR刺激的一種促有絲分裂反應(yīng)，可以導(dǎo)致DNA合成的協(xié)同增加。
?藏紅花處理對MDA-MB-231細(xì)胞乙?；降挠绊?/strong>
共鑒定和定量了431個蛋白質(zhì)中的790個乙?；?。在處理30min后發(fā)現(xiàn)17個(6個上調(diào)和11個下調(diào))差異KAc位點，12h后發(fā)現(xiàn)132個(123個上調(diào)和9個下調(diào))差異KAc位點，24h后發(fā)現(xiàn)184個(170個上調(diào)和14個下調(diào))差異KAc位點。數(shù)據(jù)顯示，治療24h后，8種乙?；鞍自诒磉_(dá)和乙酰化水平上都有顯著調(diào)節(jié)。有5種蛋白在KAc水平中上調(diào)，在蛋白表達(dá)水平中下調(diào)，包括脂肪生成調(diào)節(jié)因子、端粒酶RNA組分、α-烯醇化酶、磷酸甘油酸激酶、1和果糖二磷酸醛縮酶C。以及3種KAc水平下調(diào)，蛋白表達(dá)水平上調(diào)的蛋白質(zhì)，包括ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶3、ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶1、胸腺肽β-4。大多數(shù)KAc肽在30min后被發(fā)現(xiàn)是低乙酰化的，然而在處理12和24h后被過度磷酸化。進一步研究了與藏紅花誘導(dǎo)的賴氨酸乙?；淖兿嚓P(guān)的途徑，包括氨基酸生物合成，糖酵解/糖異生，剪接體和mRNA剪接，程序性壞死和細(xì)胞凋亡（FDR < 0.05）。
?組蛋白乙?；诓丶t花處理的MDA-MB-231細(xì)胞中的作用
在該研究中，在組蛋白H4、組蛋白H3、組蛋白H1.1和組蛋白H2.B這四個不同的組蛋白中發(fā)現(xiàn)了幾個受調(diào)控的組蛋白乙?；嚯?。通過比較三個時間點之間的組蛋白乙酰化水平，我們發(fā)現(xiàn)組蛋白H4上的一些乙酰化位點包括K5、K8、K12和K16殘基被番紅花處理后下調(diào)，而對H4的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響。這4個賴氨酸殘基的乙?；c基因組的編碼區(qū)高度相關(guān)，但與異染色質(zhì)無關(guān)。乙?；腍4尾巴產(chǎn)生一個開放的染色質(zhì)來招募負(fù)責(zé)DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)，包括用于DNA修復(fù)的ZMYND8和BRD4。因此，H4的低乙?；瘜?dǎo)致DNA修復(fù)能力下降并誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定。
另一個受番紅花處理影響的核心組蛋白是H2.B，處理24h后K13/16/17/21處的乙酰化水平下調(diào)。組蛋白N-末端的賴氨酸乙酰化導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象的結(jié)構(gòu)變化，這是轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合以進行基因轉(zhuǎn)錄以及DNA修復(fù)和重組事件所必需的。因此，這種低乙?；部梢砸种艱NA修復(fù)和沉默細(xì)胞周期檢查點。
還有一個在番紅花處理下受調(diào)節(jié)的組蛋白是H3，在處理12h后，K18/23處的乙酰化水平增加，其中乙?；腒18與基因激活有關(guān)。然而，組蛋白的高乙?；癁檗D(zhuǎn)錄因子結(jié)合創(chuàng)造了一個更寬松的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，它也可以激活腫瘤抑制基因的表達(dá)，抑制癌基因。此外，在包括乳腺癌在內(nèi)的一些癌癥中，H3在賴氨酸18上的去乙?；巧娌涣嫉嫩E象。因此它的高乙?；С至瞬丶t花醛對癌細(xì)胞存活的不良影響。
組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰基轉(zhuǎn)移酶的磷酸化調(diào)控
組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300在Ser-1038處的磷酸化水平在處理12h后下調(diào)。Ser1038的低磷酸化干擾了染色質(zhì)的縮合，增加了組蛋白H3的乙?；?。此外，p300作為腫瘤抑制因子，其在Ser-1038處的低磷酸化增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，降低了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性和增殖。
在處理30min時組蛋白去乙?；窰DAC4和HDAC7，它們經(jīng)歷了磷酸化周轉(zhuǎn)增加，在治療12h后，HDAC4在癌細(xì)胞中達(dá)到正常水平，但HDAC7的磷酸化持續(xù)增加到24h?？梢哉J(rèn)為，可能是由于DNA的損傷，在處理的前30min，細(xì)胞將HDAC4以其磷酸化的形式送到細(xì)胞質(zhì)中，使其更容易修復(fù)DNA損傷，但隨著時間的推移，HDAC4被去磷酸化并重新定位在細(xì)胞核中，從而阻止了DNA修復(fù)。核定位的HDAC4減少了乙?；?，這種減少可能會潛在地阻止細(xì)胞修復(fù)。上述結(jié)果表明，處理12h后，番紅花通過減少H4上的乙?；瘉矸乐剐迯?fù)，并通過增加H3上的乙酰化來促進促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進細(xì)胞凋亡。
該研究基于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和乙酰化蛋白質(zhì)組學(xué)分析一起提供了關(guān)于番紅花抗腫瘤作用的清晰見解。分別鑒定并定量了與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運和剪接體通路相關(guān)的4,851個調(diào)節(jié)性磷酸肽和216個調(diào)節(jié)性乙?；鞍?。在處理的早期階段，番紅花可能刺激DNA損傷，并允許細(xì)胞通過蛋白質(zhì)的磷酸化激活DNA復(fù)制檢查點來修復(fù)DNA。在這個階段，藏紅花通過共價阻斷?PTP1B磷酸酶抑制EGFR去磷酸化。番紅花還通過去磷酸化/磷酸化調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞周期、DNA復(fù)制過程和蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，顯著調(diào)節(jié)DNA復(fù)制。研究還發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；町惏ㄔ诒碛^遺傳調(diào)控和DNA修復(fù)過程中。結(jié)果表明，藏紅花醛通過促進DNA損傷、抑制DNA修復(fù)和抑制蛋白質(zhì)翻譯而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)和乙酰化蛋白質(zhì)組學(xué)揭示番紅花在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的抗癌作用
期刊名稱：Journal of Proteome Research
影響因子：5.37
樣本選擇：番紅花處理的MDA-MB-231細(xì)胞和對照細(xì)胞
技術(shù)策略：磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)和乙?；鞍踪|(zhì)組學(xué)
