前言

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，目前是致盲的主要原因之一。研究表明大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性巨噬細(xì)胞參與 DR 的發(fā)展。然而，由小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的適應(yīng)性免疫炎癥在 DR 中的作用尚不清楚。

Kdm6a 負(fù)責(zé)去除組蛋白 3 賴(lài)氨酸 27 (H3k27) 上的二甲基和三甲基基團(tuán)，并激活靶基因轉(zhuǎn)錄。Kdm6a 與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞之間的關(guān)系以及 Kdm6a 導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變的分子機(jī)制尚不清楚。

近日，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院/上海市五官科醫(yī)院韋嚴(yán)副研究員為通訊作者，在內(nèi)分泌領(lǐng)域權(quán)威期刊 Metabolism (IF: 13.934)在線發(fā)表了題為“Kdm6a deficiency in microglia/macrophages epigenetically silences Lcn2 expression and reduces photoreceptor dysfunction in diabetic retinopathy”的研究論文，發(fā)現(xiàn)了糖尿病視網(wǎng)膜病變小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的 Kdm6a 通過(guò)控制 Lcn2 的表達(dá)抑制光感受器細(xì)胞的糖酵解過(guò)程。

研究結(jié)果

1、Kdm6a 在糖尿病視網(wǎng)膜病變中上調(diào)礙

通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立了糖尿病小鼠模型（圖 1A-C），Kdm6a 蛋白和 mRNA 表達(dá)在糖尿病視網(wǎng)膜中升高（圖 1D）。暴露于高糖條件下的小膠質(zhì)細(xì)胞中 Kdm6a 表達(dá)也明顯上調(diào)（圖 1E-G）。并且小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中 Kdm6a 缺乏可能減輕 DR 誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜功能喪失（圖 1H）。

圖 1 | 糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中 KDM6A 的表達(dá)

2、Kdm6a 敲降可以降低體內(nèi)外糖尿病視網(wǎng)膜病變的炎癥反應(yīng)

與對(duì)照相比，Kdm6a 條件敲除小鼠視網(wǎng)膜中蛋白 Tnfα 和 iNos 表達(dá)下調(diào)（圖 2A）。高糖條件下特異性敲降 Kdm6a，可以導(dǎo)致 BV2 細(xì)胞中蛋白 CD11b 和 CD86 表達(dá)降低（圖 2B-C），Il1β、Tnfα、iNos、Il6 mRNA 表達(dá)降低（圖 2D）。特異性敲降 Kdm6a，可以促進(jìn) IL4 刺激的 BV2 細(xì)胞表面的 CD206 表達(dá)（圖 2F），促進(jìn) Ym1、Il13、Il10、Arg1 mRNA 的表達(dá)（圖 2E）。以上結(jié)果表明，Kdm6a 有助于 DR 中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的 M1 極化。

圖 2 | 小膠質(zhì)細(xì)胞中 KDM6A 敲降在體內(nèi)可以減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變的炎癥，在體外調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化

3、高糖通過(guò) Kdm6a 依賴(lài)性調(diào)節(jié)增強(qiáng)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中 Lcn2 的表達(dá)

接下來(lái)，對(duì)高糖條件下的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。與對(duì)照相比，Lcn2 是高糖刺激下上調(diào)為明顯的分泌蛋白基因（圖 3A）。糖尿病小鼠模型中 Lcn2 的蛋白和 mRNA 表達(dá)也顯著增加（圖 3B）。結(jié)果表明，在 DR的小膠質(zhì)細(xì)胞中 Lcn2 的表達(dá)增加。

圖 3 | 糖尿病小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中 LCN2 的表達(dá)

對(duì) si-Kdm6a 的 BV2 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示 Lcn2 表達(dá)顯著下調(diào)（圖 4A）。si-Kdm6a 的 BV2 細(xì)胞中，高糖暴露誘導(dǎo)的 Lcn2 的表達(dá)并顯著抑制（圖 4D）。無(wú)論細(xì)胞是否暴露于高糖，si-Kdm6a 的 BV2 細(xì)胞上清中的 Lcn2 蛋白水平低于對(duì)照（圖 4E）；相反，在 BV2 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) Kdm6a 可以顯著促進(jìn) lcn2 蛋白和 mRNA 的表達(dá)（圖 4F-G）。

由于 Kdm6a 作為針對(duì) H3k27me3 的去甲基化酶發(fā)揮作用并上調(diào)靶基因，結(jié)果顯示，Kdm6a 敲降顯著增加了 Lcn2 啟動(dòng)子區(qū)域 H3k27me3 甲基化水平（圖 4H），反之 Kdm6a 過(guò)表達(dá)降低了 H3k27me3 甲基化水平（圖 4I）。

以上結(jié)果表明，Kdm6a 直接降低了 Lcn2 基因的 H3k27me3 修飾水平，并促進(jìn)了 Lcn2 表達(dá)。

圖 4 | Kdm6a 對(duì)BV2 細(xì)胞中 Lcn2 表達(dá)的影響

4、Lcn2 通過(guò)抑制糖酵解而破壞感光細(xì)胞的功能

IRBP 蛋白在視覺(jué)周期中起重要作用，對(duì)光感受器的維持至關(guān)重要；外周蛋白是視盤(pán)膜的組分之一。小鼠眼睛玻璃體腔注射重組 Re-Lcn2，小鼠視網(wǎng)膜中 IRBP 和外周蛋白表達(dá)水平降低（圖 5C）。對(duì) Re-Lcn2 處理的 661W 細(xì)胞進(jìn)行非靶向代謝組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序聯(lián)合分析，結(jié)果顯示 Re-Lcn2 主要抑制了細(xì)胞中糖酵解過(guò)程（圖 5F）。代謝組檢測(cè)結(jié)果顯示 Re-Lcn2 處理顯著降低了細(xì)胞和培養(yǎng)基中乳酸水平（圖 5E, I）。

圖 5 | Re-Lcn2 通過(guò)阻斷糖酵解進(jìn)程損害感光細(xì)胞的細(xì)胞活力

收集高糖暴露的 Lcn2 敲降的 BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基，并與 661W 細(xì)胞孵育，結(jié)果顯示 sh-Lcn2 可以抵抗高糖對(duì) 661W 細(xì)胞的損傷（圖 6B），細(xì)胞的乳酸增加（圖 6D）。Kdm6a 過(guò)表達(dá)的 BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基與 661W 細(xì)胞孵育，可以降低 661W 細(xì)胞的存活率；而 sh-Lcn2 + OE-Kdm6a 的 BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基與 661W 細(xì)胞孵育，可以恢復(fù) 661W 細(xì)胞的活力（圖 6C），增加細(xì)胞的乳酸產(chǎn)生（圖 6G）。

以上表明，來(lái)自小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的 Lcn2 的增加損害了感光細(xì)胞的糖酵解進(jìn)程。

圖 6 | BV2 細(xì)胞中 Lcn2 的敲降促進(jìn)了 661W 細(xì)胞活性

5、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的 Kdm6a 缺乏維持光感受器中正常的糖酵解過(guò)程

條件敲除小鼠 IRBP 和外周蛋白表達(dá)升高（圖 7A-B）。si-Kdm6a BV2 細(xì)胞培養(yǎng)基與 661W 細(xì)胞孵育（圖 7C），661W 細(xì)胞中 IRBP 蛋白表達(dá)水平顯著上升（圖 7D），661W 細(xì)胞的存活率升高（圖 7E），細(xì)胞上清中乳酸含量增加（圖 7F）。Kdm6a 敲除減弱了 Re-Lcn2 對(duì) 661W 細(xì)胞中乳酸排泄的抑制作用（圖 7F）。暴露于 Re-Lcn2 的 BV2 細(xì)胞中 Kdm6a 敲降后，661W 細(xì)胞中糖酵解的主要酶活性的變化升高（圖 7I）。

以上結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中Kdm6a的缺失維持了光感受器的正常糖酵解，并減少了糖尿病視網(wǎng)膜病變的損害。

圖 7 | KDM6A 敲除降低糖尿病視網(wǎng)膜病變中感光細(xì)胞的功能障礙，并通過(guò)維持正常的糖酵解過(guò)程恢復(fù)感光細(xì)胞的活力

6、Kdm6a 和 Lcn2 的減少直接改善糖尿病視網(wǎng)膜病變

接下來(lái)在體內(nèi)研究 Kdm6a 和 Lcn2 的作用。將 siRNA 注射到小鼠玻璃體腔中以干擾 Kdm6a 和 Lcn2 表達(dá)，結(jié)果顯示 IRBP 和周邊蛋白表達(dá)升高（圖 8 C-D），表明體內(nèi)干擾 Kdm6a 和 Lcn2 可以改善糖尿病視網(wǎng)膜病變。

圖 8 | 通過(guò)玻璃體內(nèi)注射 siRNA 降低 Kdm6a 和 Lcn2 的表達(dá)可以減輕糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜病變

研究結(jié)論

本研究用條件敲除小鼠建立了糖尿病動(dòng)物模型，以研究 Kdm6a 缺乏的影響。

結(jié)果顯示，糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中 Kdm6a 的表達(dá)增加。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的 Kdm6a 以去甲基化酶活性依賴(lài)的方式調(diào)節(jié) Lcn2 的表達(dá)，并通過(guò) Lcn2 抑制光感受器細(xì)胞中的糖酵解進(jìn)程。這些結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的 Kdm6a 通過(guò)促進(jìn) Lcn2 表達(dá)和損害光感受者細(xì)胞中的糖解進(jìn)程而加重糖尿病視網(wǎng)膜病變。

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