實(shí)驗(yàn)是簡(jiǎn)單的，道路是曲折的，科研的道路上時(shí)間是不能浪費(fèi)的，今天就要聊一聊環(huán)凱高性價(jià)比的CCK8，讓同學(xué)們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)做的又快又好，導(dǎo)師再也不用為我們擔(dān)心啦！

1.基本原理? ?

CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒含有WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)（CAS:193149-74-5），在電子載體存在的情況下WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成水溶性的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。CCK-8法是用于測(cè)定細(xì)胞增殖或毒性實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測(cè)法,可替代傳統(tǒng)的MTT法。

2、產(chǎn)品用途? ?

CCK-8法應(yīng)用非常廣泛，主要用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)、活細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活力檢測(cè)以及生物因子的活性檢測(cè)等。

3、各種細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)方法的比較

4、CCK-8 的實(shí)驗(yàn)方法與步驟? ?

應(yīng)用場(chǎng)景一：細(xì)胞活性檢測(cè)

1.?收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入 100ul， 使待測(cè)細(xì)胞密度為1,000～10,000細(xì)胞/孔。

2.?5%?CO2，37℃ 培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少進(jìn)行調(diào)整）。

3.?每孔加入10ul?CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積200ul，則需加入 20ul?CCK-8 溶液，其它情況以此類推。

4.?在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5～4 小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等情況而定（一般情況下，白細(xì)胞較難顯色，因此需要較長(zhǎng)的CCK- 8反應(yīng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量 (～105細(xì)胞/孔)。懸浮細(xì)胞較貼壁細(xì)胞難顯色。對(duì)于懸浮細(xì)胞，在加入CCK- 8孵育1～4小時(shí)后，可先從培養(yǎng)箱中取出，目測(cè)染色程度或用酶標(biāo)儀測(cè)定決定CCK- 8最佳孵育時(shí)間。若顯色困難，可將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后再測(cè)定。對(duì)于貼壁細(xì)胞，CCK- 8的孵育時(shí)間一般為1～4小時(shí)，多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng)，培養(yǎng)3.5～4小時(shí)左右檢測(cè)效果最佳。

5.?酶標(biāo)儀于450nm測(cè)定每孔吸光度。

應(yīng)用場(chǎng)景二：細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)

1.?收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入 100ul， 使待測(cè)細(xì)胞密度為1,000～10,000細(xì)胞/孔。

2.?5%?CO2，37℃ 培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)（培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少進(jìn)行調(diào)整）。

3.?加入10ul不同濃度的待測(cè)物質(zhì)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 （例如 6、12、24 或 48 小時(shí)或72小時(shí)等，根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的活性調(diào)整孵育時(shí)間）。

4.?每孔加入10ul?CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積200ul，則需加入 20ul?CCK-8 溶液，其它情況以此類推。

5.?在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5～4 小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等情況而定（一般情況下，白細(xì)胞較難顯色，因此需要較長(zhǎng)的CCK-8反應(yīng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量 (～105個(gè)細(xì)胞/孔)。懸浮細(xì)胞較貼壁細(xì)胞難顯色。對(duì)于懸浮細(xì)胞，在加入CCK-8孵育1～4小時(shí)后，可先從培養(yǎng)箱中取出，目測(cè)染色程度或用酶標(biāo)儀測(cè)定決定CCK- 8最佳孵育時(shí)間。若顯色困難，可將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后再測(cè)定。對(duì)于貼壁細(xì)胞，CCK- 8的孵育時(shí)間一般為1～4小時(shí)，多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng)，培養(yǎng)3.5～4小時(shí)左右檢測(cè)效果最佳。

6.??酶標(biāo)儀于450nm測(cè)定每孔吸光度。

測(cè)定吸光度值（OD值）時(shí)的特別提醒：

CK8試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，例如一些抗氧化劑則會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)法去除。含有酚紅的培養(yǎng)基不影響本試劑盒做細(xì)胞活性的測(cè)定。

如何判定待測(cè)溶液是否有還原性？不含細(xì)胞的待測(cè)溶液孔中加入CCK-8溶液10μl，孵育1-4小時(shí)，測(cè)定在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度值很小，說明待檢測(cè)體系中存在較少的還原劑，正式檢測(cè)時(shí)即可直接加入CCK-8；如果該吸光度相對(duì)較大，說明待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，正式檢測(cè)時(shí)則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基和10ul?CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。

計(jì)算公式：

細(xì)胞存活率 = [（實(shí)驗(yàn)孔?—?空白孔）/ （對(duì)照孔?—?空白孔）]?×?100%

抑制率 = [（對(duì)照孔?—?實(shí)驗(yàn)孔） / （對(duì)照孔?—?空白孔）]?×?100%

實(shí)驗(yàn)孔 （含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)物質(zhì)）

對(duì)照孔 （含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8，不含有待測(cè)物質(zhì)）

空白孔 （不含細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基，含有CCK-8）

注意事項(xiàng)? ?

1.?第一次做實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議先做幾個(gè)孔摸索接種合適的細(xì)胞數(shù)量和加入CCK-8 試劑后合適的培養(yǎng)時(shí)間。

2.?接種時(shí)注意細(xì)胞懸液一定要混勻，以避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不一致。

3.?培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā)，為減少誤差，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。

4.?建議采用多通道移液器，減少平行孔間的誤差，加 CCK-8 時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，干擾 OD 值。

5.?若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8，含有酚紅的培養(yǎng)基不影響測(cè)定。

6.?CCK-8對(duì)細(xì)胞的毒性非常低，其他的實(shí)驗(yàn)，例如中性紅法或結(jié)晶紫法，也可在CCK-8 法檢測(cè)完后繼續(xù)進(jìn)行。

7.?可以使用大于 600 nm 的波長(zhǎng)，例如 650 nm，作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，CCK-8 在參比波長(zhǎng)處沒有吸光值，設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。

8.?如果實(shí)驗(yàn)中待測(cè)物質(zhì)有氧化還原劑，在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入CCK-8 試劑在一定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)，和不加藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行比較 （只加 CCK-8 試劑），如果 OD 值明顯偏高，則說明有反應(yīng)，正式檢測(cè)時(shí)則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基和10ul?CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。

9.?加 CCK-8 試劑時(shí)速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入 CCK-8 試劑后輕輕震培養(yǎng)板，為了避免加樣時(shí)由于 CCK-8 殘留在槍頭上所帶來的誤差，可以在加樣前用培養(yǎng)稀釋 CCK-8 試劑并混勻后加樣。

10.?CCK-8 反復(fù)凍融會(huì)增加背景值，干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

來源：“恩晶生物”公眾號(hào)
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