前言

在短短二十年的時間里，血管生成在傷口愈合、各種癌癥、神經(jīng)缺損、血管損傷和幾種眼科疾病的治療中的中心作用已變得明顯。延胡索乙素作為延胡索的指標成分，與保護心血管系統(tǒng)密不可分，但其在血管生成中的作用尚不明確。

本篇由北京中醫(yī)藥大學雷海民教授課題組等聯(lián)合在Pharmacological Research期刊發(fā)表了題為“Tetrahydropalmatine triggers angiogenesis via regulation of arginine biosynthesis”（IF：10.334）的研究成果，通過基于DESI-MSI空間代謝組學、GC–MS代謝組學研究方法，發(fā)現(xiàn)延胡索乙素通過調節(jié)精氨酸的生物合成觸發(fā)血管生成，有可能發(fā)展成為滿足臨床需求的藥物。

研究背景

血管生成是內(nèi)皮細胞形成新血管的過程，是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在運動或缺血時對營養(yǎng)素或缺氧的適應性反應。在短短二十年的時間里，血管生成在傷口愈合、神經(jīng)缺損、血管損傷、癌癥和幾種眼科疾病的治療中的中心作用已變得明顯。

延胡索乙素是延胡索的指標成分，具有顯著的鎮(zhèn)靜、催眠和鎮(zhèn)痛作用。延胡索乙素可以阻斷鈣通道，抑制病原菌和條件反射，保護腦組織和心血管系統(tǒng)。延胡索乙素還顯著抑制CaSr/PLCγ1通路，并保護輻射誘導的肺血管內(nèi)皮細胞凋亡，因此延胡索乙素對觸發(fā)血管生成有著重要作用。但是，延胡索乙素對血管生成的作用及其潛在作用尚不清楚。

長期以來，人們忽視了血管生成是否受到代謝“開關”的影響。重要的是，內(nèi)皮細胞代謝有助于血管發(fā)育，促進血運重建或為促/抗血管生成策略提供新的機會。作者之前已經(jīng)根據(jù)中醫(yī)臨床經(jīng)驗，通過分子對接證明了延胡索乙素和VEGFR2的結合潛力。在此，作者通過藥理試驗和基于DESI-MSI空間代謝組學、GC-MS非靶向代謝組學，在體內(nèi)雞胚絨毛尿囊膜和體外多種內(nèi)皮細胞模型中確定了延胡索乙素作為促血管生成的觸發(fā)因子。

研究思路

研究方法

1. 實驗分組

體內(nèi)：對照組、天麻素組（陽性藥物對照）和延胡索乙素組

體外：對照組、模型組、天麻素組和延胡索乙素組

2. 技術路線

2.1. 體內(nèi)雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗

2.2. 體外增殖、成管、劃痕愈傷實驗

2.3. DESI-MSI空間代謝組學、GC-MS代謝組學分析

研究結論

1. 分子對接和研究構架圖

分子對接顯示延胡索乙素可以和VEGFR2對接良好。

圖1 | 通過經(jīng)典藥理學試驗和代謝組學揭示延胡索乙素對血管生成的作用

2. 延胡索乙素以劑量依賴性方式誘導血管生成

按照圖2A進行雞胚絨毛尿囊膜實驗，設置對照組、不同濃度的延胡索乙素組和天麻素（gastrodin）組，其中天麻素是陽性對照藥物。與對照組相比，對不同組的雞胚絨毛尿囊膜樣本進行的宏觀觀察表明：延胡索乙素和天麻素的促血管生成作用主要表現(xiàn)為血管數(shù)量和血管面積增加（圖2B-C），延胡索乙素的濃度越大血管生成越明顯。通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)延胡索乙素（呈濃度依賴性）和天麻素促進VEGFR2的mRNA水平。

圖2 | 延胡索乙素呈濃度依賴性誘導體內(nèi)血管生成

3. 延胡索乙素促進體外增殖、試管形成和遷移

根據(jù)MTT的結果確定延胡索乙素的最佳體外濃度為20、40、80μM（圖3A）。同樣以天麻素（80μM）作為陽性對照藥物。使用H2O2（7.2μM for 12 h、3.6μM for 12 h）、t-BHP（11μM for 4 h、5.5μM for 4 h）和oxLDL（320μM for 12 h）造成不同的細胞損傷（圖3B），并確定t-BHP（15.5μM for 4 h）作為后續(xù)實驗條件。結果顯示，與對照細胞相比，延胡索乙素呈濃度依賴性恢復細胞活力（圖3B）、促進成管（圖3C-D）、促進劃痕愈合（圖3E-F）。

圖3 | 延胡索乙素呈濃度依賴性誘導體外血管生成

4. 非靶向代謝組學揭示了延胡索乙素調節(jié)的代謝途徑的改變

使用基于DESI-MSI空間代謝組學以及GC-MS非靶向代謝組學揭示代謝途徑的改變，圖4A-B分別為主成分分析（PCA）結果和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）結果（橫坐標表示主要成分的得分值，用于分辨組間差異；縱坐標表示正交成分的得分值，用于分辨組內(nèi)差異）。使用OPLS-DA模型的投影變量重要性（VIP）值和S-plot圖選擇候選生物標記物（圖4C），最后共鑒定出8個潛在的生物標志物（表1）。使用MetaboAnalyst進行通路分析，精氨酸生物合成被認為是延胡索乙素調節(jié)的主要通路（表2）。

圖4 | 使用DESI-MSI空間代謝組學鑒定延胡索乙素調節(jié)的生物標志物和改變的代謝途徑

隨后應用基于GC-MS非靶向代謝組學進一步揭示代謝途徑的改變，圖5A-C分別為PCA結果（含對照組、模型組和延胡索乙素組）和OPLS-DA結果（B為對照組和模型組、C為模型組和延胡索乙素組）。使用OPLS-DA模型的VIP值和S-plot圖選擇候選生物標記物，最后在對照組和模型組共鑒定出6個潛在的生物標志物（圖5D，表3），在模型組和延胡索乙素組共鑒定出1個生物標志物（圖5E，表3）。使用MetaboAnalyst進行通路分析，精氨酸生物合成同樣被認為是延胡索乙素調節(jié)的主要通路（表4）。

圖5 |? 使用GC-MS代謝組學鑒定延胡索乙素調節(jié)的生物標志物和改變的代謝途徑

5. 延胡索乙素對精氨酸生物合成的機制驗證

為了驗證延胡索乙素的機制，通過基于DESI-MSI空間代謝組學和基于GC-MS的靶向代謝組學以及藥理學分析測定與精氨酸生物合成相關的指標。結果顯示，與對照組相比，延胡索乙素降低瓜氨酸（圖6A，表5，表6）和精氨酸琥珀酸合成酶（圖6B）、升高一氧化氮（圖6C），但不影響精氨酸（圖6A，表5，表6）。體外細胞實驗顯示與對照組和模型組相比，延胡索乙素降低延胡索酸（圖6D）和精氨酸（圖6E）并升高VEGFR2蛋白水平（圖6F）。同時，延胡索乙素顯著降低t-BHP引起的氧化應激（細胞損傷）（圖6G）。

圖6 | 延胡索乙素對精氨酸生物合成的作用機制

相關討論

延胡索乙素對精氨酸生物合成和內(nèi)皮VEGFR2表達的影響，從而促進血管生成（圖7）。延胡索乙素在血管生成中的作用機制有兩個方面。首先，根據(jù)中醫(yī)理論，延胡索是一種活血化瘀藥，用于治療創(chuàng)傷愈合、神經(jīng)缺損和血管損傷等異常血管生成相關疾病。作為延胡索水提物的指標成分，作者證明，延胡索乙素可以顯著抑制瓜氨酸、延胡索酸、精氨酸琥珀酸合成酶，并刺激精氨酸，然后持續(xù)釋放NO、增強VEGFR2表達、促進血管生成和血管保護。此外，雖然延胡索乙素可以在體內(nèi)或體外激活精氨酸生物合成和VEGF表達，但體內(nèi)哪些細胞類型對延胡索乙素的促血管生成作用至關重要，仍有待確認。這些數(shù)據(jù)表明延胡索乙素是一種潛在的促血管生成先導化合物，可用于未滿足的臨床需求。盡管精氨酸生物合成增強VEGFR2功能的機制仍有待闡明，但這篇手稿表明，瓜氨酸到精氨酸的流量是血管生成調節(jié)中的一個關鍵軸，這有可能發(fā)展成為新的治療方法和藥物，以減輕氧化應激誘導的血管健康損害或病理變化。

研究結論

通過藥理學試驗和基于DESI-MSI空間代謝組、GC-MS非靶向代謝組學確定了延胡索乙素是通過調節(jié)精氨酸生物合成的促血管生成觸發(fā)物。延胡索乙素可以依次影響瓜氨酸到精氨酸的流量、精氨酸生物合成和內(nèi)皮VEGFR2的表達，從而促進血管生成。這些結果表明延胡索乙素是潛在的促血管生成先導化合物。

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中藥/單體的機制研究一直存在難點。該研究利用兩種不同的代謝組學方法（DESI-MSI空間代謝組/GC-MS代謝組學）確定了延胡索乙素對代謝的影響，除了兩種不同的代謝組學分析結果可以相互映證外，還通過體內(nèi)、體外的藥理學實驗進行了驗證。該研究為延胡索乙素的促血管生成機制提供了全新的機制，同時為中藥/單體的代謝組學機制研究提供了范本。

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（DESI-MSI空間代謝組學、GC–MS代謝組學）

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