慢病毒滴度測定（一）

整合數(shù)法標(biāo)定無熒光慢病毒滴度

維真生物-市場部

1. 病毒感染細(xì)胞

①?感染前6 h在24孔板中以2.5×10E+5細(xì)胞/孔均勻接種HEK293細(xì)胞。

②?將慢病毒進(jìn)行梯度稀釋，共做3個梯度，即每孔（500μl 無雙抗、無血清的DMEM培養(yǎng)基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒，振蕩混勻后加至接種好細(xì)胞的24孔板。

③?感染 18-20h后，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。

④感染 64-68h 后收集細(xì)胞并進(jìn)行基因組DNA的提取。

2.基因組DNA qPCR檢測

①? 提取各孔細(xì)胞基因組DNA。

②?以被測慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，慢病毒載體上的通用引物進(jìn)行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù)。

③?以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，Actin引物進(jìn)行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。

3.計算慢病毒滴度IU/mL

IU/mL=(C×N×D×1000)/V

C：平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù)；

D：病毒稀釋倍數(shù)；

N：感染時細(xì)胞數(shù)目（2.5×10E+5）；

V：加入稀釋病毒的體積。