前言

2021年5月，包括中央民族大學質(zhì)譜成像與代謝組學實驗室的再帕爾·阿不力孜教授科研團隊在內(nèi)的多個團隊（一作：王中華）在Acta Pharmaceutica Sinica B期刊發(fā)表了題為?“Spatial-resolved metabolomics reveals tissuespecific metabolic reprogramming in diabetic nephropathy by using mass spectrometry imaging ”的研究成果，通過空間分辨代謝組學研究方法，發(fā)現(xiàn)了糖尿病腎?。―N）組織中代謝物的特異性，探究了糖尿病腎?。―N）機理，同時開發(fā)新的治療策略，為糖尿?。―M）研究提供了理論依據(jù)。

中文標題：利用基于質(zhì)譜成像的空間分辨代謝組學揭示糖尿病腎病中具有組織異質(zhì)性的代謝重編程

研究對象：大鼠

發(fā)表期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

影響因子：11.413

發(fā)表時間：2021年5月

聯(lián)合發(fā)表單位：中央民族大學，中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所

運用生物技術(shù)：空間分辨代謝組學

研究背景

作為糖尿?。―M）的主要并發(fā)癥，糖尿病腎病（DN）已成為終末期腎?。‥SKD）的主要病因，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅，世界范圍內(nèi)糖尿病腎病的發(fā)病率越來越高。然而，DN發(fā)病機制的詳細代謝機制仍不清楚。DN組織特異性代謝重編程的詳細知識對于更準確地理解分子病理特征和開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。盡管基于高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）和核磁共振（NMR）的代謝組學研究極大地增強了我們對糖尿病腎病的理解，但通過HPLC?MS和NMR技術(shù)分析同質(zhì)生物樣本，如尿液、血清和腎組織勻漿等，幾乎無法獲得有關(guān)糖尿病腎病代謝產(chǎn)物空間分布的信息。

在本研究中，提出了一種基于氣流輔助解吸電噴霧電離（AFADESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）集成質(zhì)譜成像（MSI）的空間分辨代謝組學方法，來研究高脂飲食喂養(yǎng)和鏈脲佐菌素（STZ）治療的DN大鼠腎臟組織特異性代謝改變，以及黃芪甲苷IV（AST，一種潛在的抗糖尿病藥物）的治療效果。

研究思路

研究方法

圖1 | 使用氣流輔助解吸電噴霧電離（AFADESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）集成質(zhì)譜成像（MSI）對糖尿病腎?。―N）進行空間分辨代謝重編程的研究方案。

研究結(jié)果

生理、生化和組織病理學分析

圖2展示了腎臟重量、腎臟/體重比以及H&E染色腎組織的代表性顯微照片。DN組的腎臟重量和腎臟/體重比明顯高于對照組（圖2A和B）。H&E染色腎組織的組織學檢查顯示DN組大鼠的腎臟肥大和腎小球增大（圖2C和D）。與DN組相比，高劑量AST組（H-AST）的腎臟/體重比顯著降低，腎臟組織學損害也有所改善。這些生物學和病理學改變表明，未經(jīng)治療的糖尿病大鼠出現(xiàn)腎損傷，高劑量AST對這些動物的腎臟具有保護作用。

圖2 | Control組、DN組、L-AST組和H-AST組腎臟樣本信息

（A）腎臟重量

（B）腎臟/體重比

（C）整個腎臟切片的H&E染色圖像

（D）腎皮質(zhì)放大20倍H&E染色圖像

MALDI-MSI技術(shù)觀測代謝物在腎皮質(zhì)中的分布情況

如圖3所示，進一步對Control組和DN組大鼠的腎臟切片進行MALDI-MS分析，主要觀測代謝物在腎皮質(zhì)的分布情況。例如，m/z= 786.5315處的磷脂酰絲氨酸（PS（36:2））僅分布于腎小球，m/z =762.5103處的磷脂酰乙醇胺（PE（38:6））分布于腎小球周圍，m/z =346.0567處的一磷酸腺苷AMP分布于皮質(zhì)的其他區(qū)域。因腎皮質(zhì)富含腎小球，易受糖尿病腎損害，而成像結(jié)果揭示了鑒別代謝物在腎皮質(zhì)的一個精確分布。

圖3 | 部分物質(zhì)MALDI-MSI質(zhì)譜圖像

（A）腎皮質(zhì)的H&E染色圖像,黑圈表示腎小球

（B）一磷酸腺苷（AMP）成像圖

（C）磷脂酰乙醇胺（PE（38:6））成像圖

（D）磷脂酰絲氨酸（PS（36:2））成像圖

（E）B、C和D的合并圖像

AFADESI-MSI成像技術(shù)研究糖尿病大鼠腎臟中的糖代謝途徑紊亂

圖4展示了參與葡萄糖代謝的代謝物的空間分布和變化。葡萄糖是腎臟的主要能量底物，腎臟利用了體內(nèi)大約10%的葡萄糖。葡萄糖的代謝途徑在腎臟的不同區(qū)域有所不同。在本研究中，對照組的腎外髓質(zhì)中觀察到最高濃度的葡萄糖，這可能是因為該區(qū)域廣泛吸收和利用葡萄糖，而鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白（SGLT）主要分布在該區(qū)域。DN大鼠腎皮質(zhì)葡萄糖水平顯著升高，這與系統(tǒng)葡萄糖含量的增加相一致。然而，DN大鼠腎外髓質(zhì)的葡萄糖水平顯著低于對照組大鼠。此外，DN大鼠腎外髓質(zhì)葡萄糖6-磷酸和甘油醛3-磷酸水平顯著高于對照組大鼠。這些結(jié)果表明，在腎外髓質(zhì)中存在葡萄糖的過度利用和葡萄糖進入糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑（PPP）的代謝流量增加。

葡萄糖也可以通過山梨醇脫氫酶代謝產(chǎn)生山梨醇，糖尿病大鼠腎皮質(zhì)和髓質(zhì)內(nèi)的山梨醇水平也顯著升高。山梨醇的積累表明，葡萄糖代謝通量增加，進入腎臟的多元醇途徑，據(jù)報道，這與DN的發(fā)病機制有關(guān)。

圖4 | AFADESI-MSI成像技術(shù)研究Control組和DN組腎臟中參與葡萄糖代謝途徑的代謝物

圖注：W:全腎切片; ?C:腎皮質(zhì); ?OM:腎外髓質(zhì); ?IM:內(nèi)髓質(zhì); ?Control:對照組; ?DN:糖尿病腎病組; ?PPP: 磷酸戊糖途徑；Polyol pathway: 多元醇途徑 ；Glycolysis: 糖酵解；

AFADESI-MSI成像技術(shù)研究糖尿病大鼠腎臟中的三羧酸（TCA）紊亂

TCA循環(huán)中涉及的空間代謝物分布和變化如圖5所示。檸檬酸和蘋果酸是TCA循環(huán)中眾所周知的中間產(chǎn)物。與對照組大鼠相比，糖尿病腎病大鼠體內(nèi)的維生素E水平顯著降低。琥珀酸是TCA循環(huán)中的另一種重要中間體，也是琥珀酸脫氫酶（SDH）的底物，SDH是線粒體膜電子傳遞鏈的一部分，可以催化琥珀酸形成富馬酸。DN大鼠腎外髓質(zhì)的琥珀酸水平高于對照組大鼠。DN大鼠腎臟中與TCA循環(huán)相關(guān)的氨基酸水平，包括谷氨酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸和亮氨酸/異亮氨酸，也顯著降低。這些TCA中間產(chǎn)物和TCA循環(huán)相關(guān)代謝物的紊亂表明DN大鼠腎臟SDH活性降低和線粒體功能障礙，已被確定為幾種糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的重要因素。

圖5 | AFADESI-MSI成像技術(shù)研究Control組和DN組腎臟中參與TCA循環(huán)代謝途徑的代謝物

AFADESI-MSI成像技術(shù)研究糖尿病大鼠腎臟中核苷酸代謝中斷

參與核苷酸代謝的空間代謝物分布和變化如圖6所示。AMP（一磷酸腺苷）、ADP（二磷酸腺苷）和GMP（單磷酸鳥苷）主要分布于對照組大鼠的腎外髓質(zhì)。然而，在糖尿病狀態(tài)下，這些代謝物的分布模式發(fā)生了顯著變化。在糖尿病狀態(tài)下，AMP和GMP在腎外髓質(zhì)的水平顯著降低，但在腎皮質(zhì)的水平顯著升高。而ADP和ATP（三磷酸腺苷），在糖尿病大鼠的腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)中觀察到它們的水平顯著增加，表明這些區(qū)域的ATP周轉(zhuǎn)加快，這可能與腎臟功能亢進有關(guān)，例如腎小球濾過率Na和水的吸收增加，以及轉(zhuǎn)運Na/K的ATP酶泵活性的改變，這就是糖尿病狀態(tài)的一種表征。

肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿酸和尿苷是AMP、GMP和一磷酸尿苷（UMP）的分解代謝產(chǎn)物，主要分布在對照組的腎皮質(zhì)，DN大鼠腎臟中這些代謝物的水平趨于降低，表明AMP、GMP和UMP分解代謝減少。

圖6 | AFADESI-MSI成像技術(shù)研究Control組和DN組腎臟中參與核苷酸代謝途徑的代謝物

圖注：W:全腎切片;? C:腎皮質(zhì); ?OM:腎外髓質(zhì); ?IM:內(nèi)髓質(zhì); ?Control:對照組; ?DN:糖尿病腎病組;

AFADESI-MSI成像技術(shù)研究糖尿病大鼠腎臟中脂質(zhì)代謝的失調(diào)

如圖7所示，再在這項研究中，作者觀察到與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的各種代謝物水平和空間分布的變化，包括DN大鼠腎臟中的脂肪酸、溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）、溶血磷脂酰甘油（LysoPG）、磷脂酸（PA）、二酰甘油（DAG）、磷脂酰膽堿（PC）、PE、PS和鞘磷脂（SM）。

DN組腎皮質(zhì)油酸濃度顯著升高，多不飽和脂肪酸（PUFA）的水平，包括亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸（DPA）（圖7B2-B7），主要分布在對照組的腎皮質(zhì)，在糖尿病狀態(tài)下腎臟的不同區(qū)域趨于降低，排除腎外髓質(zhì)中的DPA。結(jié)合已有文獻研究表明油酸水平升高和多不飽和脂肪酸水平降低表明DN大鼠的腎臟可能發(fā)生了增加的腎臟炎癥。

作者觀察到，在DN組中，DAG（18:1/18:1）、DAG（18:1/18:2）、PC（32:0）、PC（34:1）、PC（36:2）、PC（36:1）、PC（38:4）、PC（38:5）和LysoPC（16:0）在腎切片上大量沉積，尤其是在外髓質(zhì)（圖7B8-B15和B23）。結(jié)合已有文獻研究表明脂質(zhì)在腎臟中積聚，并與腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷有關(guān)，可能與脂質(zhì)代謝基因的功能失調(diào)有關(guān)。

DN組腎外髓質(zhì)中的LysoPG（18:1）和LysoPG（20:4）水平顯著升高，腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)中的LysoPG（22:6）水平顯著降低（圖7B24-B26）。此外，僅分布于腎皮質(zhì)的PA（P-34:2）/PA（O-34:3）水平在糖尿病組也顯著降低（圖7B16）。結(jié)合已有文獻研究表明LysoPG和PA水平的改變可能導致CL的病理性重塑，這被認為是線粒體功能障礙相關(guān)糖尿病的病因。

DN大鼠腎臟中PE（P-38:6）、PE（38:6）、PE（38:4）、磷酰乙醇胺和甘油基磷酰乙醇胺的水平顯著降低（圖7B17-B19、B27和B28）。然而，DN大鼠腎外髓質(zhì)的PE（36:4）水平顯著升高（圖7B20）。結(jié)合已有文獻研究表明腎臟PE水平的改變可能導致電子傳遞鏈復合物活性、呼吸能力和線粒體ATP生成減少。

DN大鼠腎臟的PS（36:2）水平顯著降低（圖7B21）。如圖3，我們知道PS（36:2）只在腎皮質(zhì)的腎小球中分布。PS（36:2）在腎小球中的特異性分布表明，PS（36:2）可能在糖尿病腎小球硬化中發(fā)揮重要的生物學作用，這可能是糖尿病腎病的一個新的治療靶點。

Control組的SM（d18:1/16:0）主要分布在腎皮質(zhì)，但DN組的腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)顯著增加（圖7B22）。結(jié)合已有文獻研究表明SM（d18:1/16:0）在腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)的積聚可能抑制AMPK活性，并有助于脂質(zhì)沉積。

圖7 | AFADESI-MSI成像技術(shù)研究Control組和DN組腎臟中參與脂質(zhì)代謝途徑的代謝物

（A）脂質(zhì)代謝的簡化概述

（B）Control組和DN組腎臟中參與脂質(zhì)代謝途徑的代謝物

AFADESI-MSI成像技術(shù)研究糖尿病大鼠腎臟中的肉堿穩(wěn)態(tài)障礙

如圖8所示，在對照組的皮質(zhì)和外髓質(zhì)中檢測到高強度的L-肉堿和短鏈?；鈮A，包括乙酰肉堿和酰基肉堿C4:0，但在DN組的腎皮質(zhì)中顯著降低（圖8A和C）。長鏈?；嵬?，包括?；嵬14:0、酰基卡尼汀C16:1、?；嵬16:0、酰基卡尼汀C18:1和?；嵬18:0，主要分布在對照組的腎外髓質(zhì)，但在DN的腎臟中顯示出顯著的蓄積（圖8D-H）。腎臟肉堿譜的改變可能與DN中線粒體酸氧化功能障礙和三羧酸循環(huán)活性的改變有關(guān)。

圖8 | AFADESI-MSI成像技術(shù)研究Control組和DN組腎臟中L-卡尼汀及其衍生物的變化

研究結(jié)論

結(jié)合AFADESI-MSI和MALDI-MSI的優(yōu)勢，提出了一種空間分辨代謝組學方法來研究糖尿病腎臟的區(qū)域特異性代謝改變以及AST對DN的治療效果。AFADESI-MSI鑒定了大量與DN相關(guān)的代謝物，并顯示了它們在大鼠腎臟中獨特的空間分布模式，而MALDI-MSI的加入提高了AFADESI檢測到的代謝物的空間分辨率。結(jié)果表明，DN大鼠腎臟糖酵解和PPP活性增加、線粒體功能障礙、AMPK抑制、脂質(zhì)代謝紊亂、肉堿、氧化還原（附件）和滲透平衡破壞（附件）均以區(qū)域特異性方式發(fā)生。通過反復口服黃芪甲苷IV（100 mg/kg）12周，這些區(qū)域特異性代謝紊亂得到改善。

本研究為糖尿病大鼠腎臟組織特異性代謝重編程和分子病理特征提供了更全面、更詳細的信息。新發(fā)現(xiàn)的腎小球特異性鑒別代謝產(chǎn)物PS（36:2）可用于定位腎小球和尋找DN的腎小球特異性生物標志物。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了AFADESI和MALDI整合的基于MSI的空間代謝組學方法在代謝性腎臟疾病中的強大作用。

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