琥珀酰亞胺酯（SE，也稱為?NHS?酯）與伯胺反應(yīng)，例如蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基。 琥珀酰亞胺酯標(biāo)記通常用于結(jié)合蛋白質(zhì)和抗體。 該反應(yīng)需要目標(biāo)蛋白上的胺基去質(zhì)子化并與?SE?反應(yīng)的堿性?pH，通常在?pH 8.3?的碳酸氫鹽緩沖液中進(jìn)行。 琥珀酰亞胺酯染料具有在水存在下隨時間水解的缺點(diǎn)。 多磺化染料，例如?Alexa Fluor??染料、DyLight??染料和?IRDye??尤其具有吸濕性，會加劇水解問題。

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艾美捷AT 655?琥珀酰亞胺酯：

Cat#：B-CHM502/B-CHM503/B-CHM504/B-CHM505

規(guī)格：1 mg

儲存：在-20°C下儲存，避光

形態(tài)：結(jié)晶固體

光譜特性：見上文

儲存條件：儲存溫度為-20°C，避光。

穩(wěn)定性：在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下穩(wěn)定至少12個月。

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用AT NHS標(biāo)記蛋白質(zhì)的建議方案：

AT NHS酯很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)。NHS酯結(jié)合的合適pH范圍是pH

8.0-9.0。在這個pH范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的氨基，特別是賴氨酸的氨基，被充分去質(zhì)子化以進(jìn)行快速偶聯(lián)。

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AT 655?琥珀酰亞胺酯所需材料：

1、溶液A:PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4）：將8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4-2H2O和0.24 g KH2PO4溶解在1L蒸餾水中。

2、溶液B:0.2 M碳酸氫鈉溶液，用2 M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至9.0。

3、溶液C：將20份溶液A和1份溶液B混合，得到pH為8.3的標(biāo)記緩沖液。將該溶液儲存在密封瓶中，以保持長期穩(wěn)定性。

4、溶液D：將1.0 mg NHS酯溶解在50-200 ul無水、不含胺的二甲基亞砜（DMSO）或乙腈中。

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蛋白質(zhì)結(jié)合物的儲存

通常，綴合物的儲存條件應(yīng)與未修飾蛋白質(zhì)的儲存條件相同。當(dāng)溶液在4℃下儲存時，建議添加疊氮化鈉作為防腐劑（最終濃度為2mM）。在將綴合物添加到活細(xì)胞標(biāo)本中的應(yīng)用中，可能需要在使用前去除防腐劑以避免抑制作用。綴合物應(yīng)在4C下穩(wěn)定數(shù)月。對于長期儲存，溶液可以分成等分試樣，并在-20°C下冷凍。避免重復(fù)冷凍和解凍。染料偶聯(lián)物應(yīng)盡可能存放在避光的地方。

確定平均標(biāo)記度（DOL）

平均標(biāo)記度（DOL）表示染料分子與蛋白質(zhì)分子的比例，可以通過吸收光譜法使用朗伯-比爾定律來確定：吸光度（A）=消光系數(shù)（e）×摩爾濃度x路徑長度（d）。在石英（紫外透明）比色皿中凝膠過濾后，只需測量共軛溶液的紫外-可見光譜。如果溶液濃度過高，無法準(zhǔn)確測量吸光度，則可能需要稀釋溶液。在染料的最大吸收波長（abs）和280nm（A280）（蛋白質(zhì)的最大吸收率）下測量吸光度（Ama）。染料濃度的計(jì)算公式為：c（染料）=Ama/Emx x d，其中Ema是染料在最大吸收波長下的消光系數(shù)。類似地，基于280 nm處的吸光度，使用公式確定蛋白質(zhì)濃度：c（蛋白質(zhì)）=Apot/Eprot x d，其中Eprot是280 nm處蛋白質(zhì)的消光系數(shù)。由于所有染料在280nm處都具有一定的吸光度，因此必須根據(jù)染料的貢獻(xiàn)來校正在A280處測量的吸光度。蛋白質(zhì)濃度可計(jì)算為：Aprot=A28o-Amax×CF28o，然后c（蛋白質(zhì)）=Anot/Eprotxd。標(biāo)記程度，代表與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的染料分子的平均數(shù)量，可以基于

關(guān)于上述關(guān)系。

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僅供研究使用，不用于人類或臨床診斷